1980年美国Lehrer实验室从兔肺巨噬细胞中首先分离得到的、阳离子性极强的小分子抗菌肽，称为defensin，后被称为α-防御素。人类α-防御素分为髓源性防御素（HNP1-4）和肠源性防御素（HD-5和HD-6）。HNP1-4主要分布于人多形核中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophils，PMN）内，故又称为人中性粒细胞肽（HNPs），是天然免疫的重要组成部分。
1 HNPs的来源、基因与结构特征
PMN是HNPs的主要来源，HNPs是小的（3 500～4 000）阳离子肽，储存在PMN的嗜天青颗粒中，当PMN活化的时候释放出来。Driss等研究发现嗜酸粒细胞经牛分枝杆菌刺激后剂量依赖性地表达HNPs，并且嗜酸粒细胞HNPs的释放依赖TLR2。在其他的白细胞子集比如自然杀伤细胞、B细胞、γδT细胞、单核细胞和巨噬细胞以及不成熟的单核细胞来源的树突状细胞（immaturemonocyte-derived dendritic cells，imMDDCs）中也有发现。编码HNP1-4的基因称为DEFA1-4，定位于8号染色体的p23.1-p23.3区域，全长基因由3个外显子和2个内含子组成，其cDNA全长约为750 bp。HNP1-3氨基酸序列几乎完全相同，如XCYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC，其中“X”在HNP-1中为丙氨酸，HNP-2中为天冬氨酸，而在HNP-3中缺如。HNP-4由33个氨基酸组成，相对分子质量为3 700，与前三者相差较大，只有33%的氨基酸序列一致而且更具有疏水性。HNPs含有6个保守的半胱氨酸残基，分子内二硫键的连接位置分别为Cys1-Cys6、Cys2-Cys4、Cys3-Cys5，其中CyS1-Cys6连接N端和C端，形成分子大环。
2 HNPs的生物学特性
2.1 抗微生物作用 HNPs具有广谱抗菌活性，可有效地杀伤多种微生物，包括革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌、包膜病毒、分枝杆菌、梅毒螺旋体等。其杀菌机制为HNPs使微生物细胞膜通透性增加。HNPs抗革兰阳性菌（金黄色葡萄球菌）效应表现为HNP-2＞HNP-1＞HNP-3＞HNP-4，而抗革兰阴性菌（大肠杆菌）效应表现为HNP-4＞HNP-2＞HNP-1—HNP3。HNP1和HNP2可以诱导甲型流感病毒的聚集并增加中性粒细胞摄取甲型流感病毒。HNP1-3可以使多种细菌毒素失活，包括炭疽致病因子、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素A等。最近研究发现HNP-1启动寄生虫DNA断裂导致桔氏椎虫死亡。
2.2免疫作用 HNPs驱动树突状细胞（dendritic cells，DCs）活化并且增加DCs刺激T细胞的能力。Presicce等研究发现HNP-1处理后DCs表面共刺激分子CD80、CD86、CD40以及成熟标记CD83和HLA-DR明显上调，显示了HNP-1有效地促进单核细胞来源的树突状细胞（monocyte-derived dendritic cells，moDCs）的活化和成熟。此外，HNPs使moDCs表达CD91上调，推测其通过促进受体的上调而放大它们对DCs的作用。在黏膜表面，DCs也是人类免疫缺陷病毒（HIV）感染的重要靶细胞之一，HIV利用DCs将抗原递呈给CD4+T细胞，从而介导HIV感染CD4+T细胞。由imMDDCs产生的HNP1-3将促进单核细胞、不成熟T细胞和其他的imMDDCs到感染的黏膜炎症部位。在DCs未感染的条件下，HNP1-3将发挥有效的灭活病原菌的作用。由于HNPs可以促进人类DCs的聚集和刺激细胞因子的产生，因此可能将其用于DCs的减少、成熟障碍或者细胞因子产生不足的临床治疗。
2.3 细胞毒作用 高浓度的HNPs对细胞是有毒性的，对正常繁殖与恶性增生的哺乳动物细胞都具有较强的非特异杀伤作用。研究显示48 h时50 μg/ml HNPs对白血病T淋巴细胞和A549细胞溶解明显，而16 h时25 μg/ml HNPs对肾上皮肿瘤细胞有细胞毒性，目前关于防御素对肿瘤细胞毒性作用的机制尚不十分清楚。HNP1-3释放副细胞外可引起组织损伤，高浓度的HNPs（＞20 μg/ml）对气道上皮细胞有细胞毒性，因此HNP1-3被认为与多种中性粒细胞相关肺疾病的发病机制有关。
3 HNPs与PMN的相互作用
3.1PMN分泌HNPs Miles等检测发现PMN在体外培养4h后开始释放HNPs，此外当中性粒细胞发生凋亡的时候HNP1-3的浓度呈时间依赖性增加，9h浓度达到高峰，提示HNPs的释放与不断凋亡的PMN相关。HNPs在坏死的PMN上清液中的表达量较高，浓度为（8～15）±0.45μg/ml。当坏死的PMN发生碎裂的时候也释放HNPs，研究发现注入坏死的PMN可以明显减少鼠伤寒株SL3261感染小鼠脾脏中细菌的数量并且减少血清中肿瘤坏死因子α。
3.2 HNPs聚集并活化PMN HNPs在炎症性肺疾病的血浆和痰中的表达增高，提示HNPs可能有促进炎性肺病中肺损伤的作用。虽然HNPs对PMN没有直接的趋化作用，但是HNPs刺激人肺上皮细胞通过转录调节白介素8（IL-8）mRNA诱导IL-8的产生，IL-8是聚集并活化PMN的趋化因子。Khine等研究发现HNPs刺激细胞产生IL-8的作用被P2Y6反义寡核苷酸完全抑制，因此HNPs诱导肺上皮细胞IL-8的产生主要是由G蛋白耦联受体P2Y6受体介导。Yang等研究得到豚鼠a-防御素通过增加黏附分子ICAM-1、CD11b和CD11c的表达诱导活化PMN，上调吞噬细胞黏附分子的表达不仅促进吞噬细胞的聚集，也促进它们的活化，从而增强它们杀灭微生物的活性。
3.3 HNPs抑制PMN凋亡 当PMN单独在37℃下孵育18 h后会有＞50%的细胞发生凋亡，而Nagaoka等研究发现PMN与HNP-1（5～40 μg/ml）共同孵育后自发性凋亡被抑制，表现为显著抑制了 Caspase-3的活性，而上凋Bcl-x1，同时HNP-1抑制了线粒体膜蛋白的改变。PMN表面有P2Y6受体表达，进一步研究将PMN直接与P2Y6激动剂UDP共孵化，结果显示UDP依赖剂量（30～3 000 μmol/L）抑制PMN凋亡，而P2Y6拮抗剂MRS2578 （1 μmol/L》显著降低了HNP-1和UDP诱导抑制PMN凋亡，从而证明了P2Y6信号途径参与了HNP-1诱导抑制PMN凋亡。
3.4 H NPs对PMN功能的影响大量的PMN和高浓度的HNPs均被认为能杀灭细菌，然而肺囊性纤维化（CF）患者严重的细菌感染持续存在。在CF患者痰中HNPs浓度[（413士22）μg/ml]较健康对照组[（0.14±0.01）μg/ml]高，从CF患者痰中分离的PMN数量比健康对照组多。PMN具有吞噬微生物的能力。Voglis等研究发现CF患者痰中分离出的PMN与健康对照者诱导痰中分离的PMN相比吞噬能力减弱，对吞噬功能起关键作用的3个表面受体包括CR1、CR3、FcrRⅢ作进一步研究，结果显示在CF患者痰中分离的PMN表面受体FcrRⅢ的表达较健康对照者低，肌动蛋白在PMN吞噬过程中起关键作用，而FcrRⅢ能调节肌动蛋白的苇新分布，肌动蛋白细胞骨架在HNPs刺激后破坏成点状或球状结构，从而使CF患者痰分离的PMN表型发生改变。
4 HNPs对肺上皮细胞的影响
4.1 低浓度HNPs促进肺上皮细胞损伤修复 有研究发现4～10 μg/ml HNP1-3呈剂量依赖的方式诱导A549细胞增生。许多研究显示表皮生长因子受体和MAPK信号通路参与细胞增生，然而HNPs诱导细胞增生不被表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂AG1478抑制，而完全被有丝分裂原激活蛋白酶抑制剂U0126抑制，表明HNPs诱导细胞增生可能通过下游MAPK信号通路介导。尽管HNPs诱导细胞增生可能有利于人体防御，但是当局部HNPs浓度缺乏控制，过度和长期刺激细胞增生可能也会造成不利影响。在慢性支气管炎患者支气管活组织切片中上皮细胞增生比例比正常人和哮喘患者增多，推测HNPs参与上皮细胞化生，比如鳞状细胞和黏液细胞化生，这些常与PMN炎症有关。
4.2 高浓度HNPs导致肺上皮细胞凋亡 研究发现高浓度的HNP-1（10～20 μg/ml）引起肺上皮细胞A549细胞出现凋亡的形态学改变以及Caspase-3活性增加。共焦显微镜观察HNP-1在30 min内转移并定位至内质网而不需要聚集到细胞膜，推测其细胞凋亡机制可能与内质网应激有关而不是细胞膜受体介导。也有研究发现A549细胞与50μg/ml HNP1-3共培养3h，胞浆中细胞色素C的含量增加，并用TUNEL法检测，结果显示与培养基细胞相比凋亡细胞明显增加，表明HNP1-3也引起DNA断裂。
4.3 HNPs促进肺上皮细胞免疫反应 Vaschetto等研究发现，HNPs刺激诱导肺上皮细胞表面表达CD51（ICAM-1）、CD81、CD86以及相应的主要配体CD11a（LFA-1）、CD152（CTLA-4）和CD28在CD4+淋巴细胞表面表达。因此，HNPs通过活化肺上皮细胞和CD4+淋巴细胞内共刺激分子在连接天然免疫和获得性免疫中发挥重要作用。HNPs通过上调黏附分子ICAM-1增加细胞黏附，从而促进A549细胞和CD4+淋巴细胞的相互作用。因此，CD4+淋巴细胞黏附到肺上皮细胞可能更进一步引起并延长免疫反应。
4.4 HNPs增加气道上皮细胞黏液分泌 在呼吸道中，黏液分泌对人体对抗病原体和刺激物有保护作用，而且黏液层有助于清除吸入的异物，然而慢性呼吸道感染的患者气道黏液分泌也是一个重要的病理特征，可以导致气道阻塞和气体交换受损。在已被证实的19种MUC基因中MUC5AC是气道表面上皮细胞分泌的主要呼吸系统黏蛋白。Ishimoto等利用人气道黏膜上皮细胞系NCI-H292细胞检测HNP-1在MUC5AC黏蛋白分泌中的作用，研究发现HNP-1激活细胞表达MUC5AC，并且在10 mg/L HNP-1中MUC5AC mRNA和蛋白的表达水平最高，此外，低剂量的HNP-1和LPS并不影响MUC5AC的产生，但是10 mg/L HNP-1和10 ng/ml LPS同时刺激显示对NCI-H292细胞MUC5AC mRNA和蛋白表达水平的累加效应。
4.5 HNPs破坏肺屏障功能 Bdeir等利用细菌人工染色体10构建能表达α-防御素的转基因小鼠（Def+/+），在小鼠气管内注入pH≈2的HC12.5 μl/g诱导急性肺损伤，结果显示Def+/+小鼠生存时间（420 min）较WT小鼠（1 200 min）明显短，此外，免疫组织化学显示Def+/+小鼠肺组织中α-防御索的量较多而WT小鼠肿组织中没有表达，同时Def+/+小鼠肺表现出明显的肿胀和发红，由此可见肺组织中α-防御索的释放与肺毛细血管内皮和肺泡上皮的通透性增加相关从而加重了急性肺损伤，进一步研究还发现α-防御素破坏肺毛细血管-内皮屏障作用是通过低密度脂蛋白受体相关蛋白信号转导介导。
5 HNPs与PMN相关的肺部疾病
5.1 HNPs与肺炎 肺炎链球菌是导致社区获得性肺炎、鼻窦炎、中耳炎和脑膜炎的主要病原体，Beiter等将有荚膜菌株（血清型1、2，4、9V）和相应的无荚膜菌株（血清型1R、2R、R6、4R、9VR）分别置于3.75 μg/ml和7.5μg/ml HNP1-3中培养，菌株的死亡均呈剂量依赖的方式，且有荚膜的菌株更有效地被杀死，这些结论否定了荚膜是抗菌肽介导抗菌作用的阻力。在无荚膜的菌株中引进阳离子表面电荷或者减少阴离子表面电荷可以对抗HNP1-3的作用，而没有发现阴离子电荷的荚膜和无电荷的荚膜与HNP1-3敏感性的关系，因此，荚膜参与防止表面电荷的修饰机制仍需要进一步研究。
5.2 HNPs与肺结核 Ashitani等研究发现，活动性肺结核（TB）患者治疗前血浆HNPs浓度[（437±38）ng/ml]比健康对照者高[（230±28）ng/ml，P＜0.05]，支气管肺泡灌洗液（BALF）中HNPs浓度[（1 245±314）ng/ml]比正常对照者高[（14±4）ng/ml，P＜0.000 1]。用反相HPLC法测定正常对照者血浆中成熟的HNPs与前体防御素比例为3：1，而TB患者比例为4：9，因此血浆中HNPs可能直接反映TB患者骨髓刺激的程度。活动性TB患者血浆和BALF中HNPs的浓度均增高，提示HNPs可能参与导致TB患者肺功能紊乱，而这些多肽类可能作为评价疾病严重程度新的参数。而耐多药/多耐药肺结核患者血浆HNP1-3的浓度在经抗结核治疗前后均低于正常，且与痰菌阳性持续时间以及影像学记分呈负相关，提示HNP1-3表达水平减少可能是耐多药肺结核形成的原因之一，同时检测到耐多药肺结核患者HNPl-3浓度低于60 ng/ml，因此提出HNP1-3表达水平可能作为耐多药肺结核的标记。
5.3 HNPs与慢性阻塞性肺疾病（COPD）COPD急性加重期组诱导痰中HNP1-3表达水平明显高于COPD稳定期组和健康对照组，并且COPD患者诱导痰中HNP1-3表达水平与FEV1占预计值%、FEV1/FVC和PaO2呈负相关，表明COPD病情越严重，痰中HNP1-3水平越高，提示痰中HNP1-3水平可以作为COPD严重程度的指标。Paone等对71例吸烟者进行检测，结果显示COPD患者痰HNPs浓度比有症状吸烟者高[（14±1.5）μg/ml vs （1.6±0.4）μg/ml，P＜0.000 1]，阻塞程度严重的COPD患者比轻、中度COPD患者HNPs浓度更高[（19.9±2.3）μg/ml vs（10.3±0.8）μg/ml，P=0.003]。重度COPD患者痰中测得的HNPs表达水平超过了对气道上皮细胞、肺纤维母细胞以及肺泡巨噬细胞的细胞毒作用的浓度。尽管体外检测发现COPD患者痰中HNPs表达水平显示出细胞毒性，但是它们在体内的活性仍需要检测，因为一些甚至大部分HNPs被黏附到α1-AT、黏多糖和核酸而失去作用。
5.4 HNPs与哮喘 哮喘被认为是一种异质性的疾病，根据外周血或痰中存在或缺乏粒细胞分为4种不同哮喘类型，即嗜酸粒细胞型哮喘、中性粒细胞型哮喘（NA）、嗜酸粒细胞/中性粒细胞混合型哮喘和寡粒细胞型哮喘。Baines等研究发现，NA中HNPs（DEFA1、DEFAIB、DEFA3和DEFA4）、中性粒细胞组织蛋白酶G和弹性蛋白酶（ELA2）基因表达明显升高，由于HNPs和中性粒细胞蛋白酶基因表达与气道PMN聚集有明显的相关性，并且NA中系统PMN活化和迁移至气道增加，提示HNPs和中性粒细胞蛋白酶参与了该过程，从而提出外周血基因表达HNPs和中性粒细胞蛋白酶用于鉴定NA的可能。Vega等提出HNPs可能通过黏附于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族如α1-蛋白酶抑制剂的膜表面促进肺上皮细胞损伤，此外，哮喘患者更容易发生感染，这个效应可能是由于HNPs的ADP-糖基化引起，在哮喘患者BALF中已经发现了ADP-糖基化的HNPs，HNPs的ADP-糖基化改变了防御素的生物特性，降低了抗菌活性，维持了促炎特性。
5.5 HNPs与急性呼吸窘迫综合征（ARDS）ARDS是以增加肺泡毛细血管屏障和肺泡上皮损伤为特征。临床病理研究显示PMN在ARDS发病机理中发挥重要作用，然而ARDS患者和健康对照者PMN的成熟、内容物以及功能的差别尚不清楚。Ashitani等检测发现ARDS患者血浆中HNPs的浓度[（2012±1 389）ng/ml]比健康对照者[（271±153）ng/ml]高，BALF中HNPs的浓度[（726±848）ng/ml]亦高于健康对照者[（14±14）ng/ml]。利用RP-HPLC的方法检测健康对照者血浆中成熟HNPs与前体防御素的比例为3：1，而ARDS患者成熟HNPs与前体防御素的比例为1：5。BALF中高水平的HNPs可能是感染部位活化的PMN释放的成熟防御素。然而，同样的患者血浆中HNPs主要来源于骨髓的中性粒细胞前体细胞。在ARDS中活化的炎症细胞释放介质刺激骨髓，促进不成熟中性粒细胞和前体防御素从骨髓中释放到外周循环。因此，血浆HNPs可能直接反映骨髓刺激的程度。这一推测也由ARDS患者外周血中性粒细胞计数以及杆状核细胞计数均高于正常对照者得到证实。
6 展望
HNPs具有免疫防御功能，体内HNPs先天分泌不足或缺乏时气道防御功能下降。HNPs与PMN密切相关，在炎症性疾病中PMN凋亡延迟并产生高浓度的防御素，造成组织细胞损伤。可见，HNPs在适当浓度范围对机体有利，而HNPs不足或者浓度过高则损害宿主防御或造成组织损伤。在炎症性疾病中HNPs浓度升高，是否可以利用其判断疾病病情严重程度，作为疾病诊断的标准之一，仍有待进一步证实。目前，HNPs在疾病中的作用尚不十分清楚，可能参与疾病的发生，是否可以通过促进PMN凋亡以及增加巨噬细胞对凋亡PMN的清除来控制HNPs的浓度，从而控制炎症并减轻组织细胞损伤，成为治疗炎症性肺部疾病新的靶点，尚需对其做进一步研究。
