肿瘤免疫治疗文献分享十日谈之三

这是一篇cell的代谢子刊，包含了外泌体，代谢，PD-1，肿瘤转移前微环境（PMN）,巨噬细胞五个主要因素。该研究主要是讲肿瘤来源的外泌体刺激了肿瘤转移前微环境中巨噬细胞向免疫抑制表型的转化，通过NF-κB依赖，糖酵解主导的代谢重编程途径，从而促进了肿瘤转移。这些转移前的巨噬细胞主要特征是PD-L1合成源头增加并且乳酸的生成增加。

这篇文章的工作量十分庞大，读起来也十分困难。论证层次十分深入。多癌肿，体内体外均有不同程度的重复验证。主要用到的都是基本的实验技术，也用到了较为高端的CRISPR/Cas9基因编辑技术。

先引出一个现象，然后再探究解释其中的机制，肿瘤来源的外泌体（TDEs）可以促进肿瘤转移，并且能增加巨噬细胞表面PD-L1的表达。外泌体是从他们母细胞中分泌出来到组织中的。 所以首先探究肺癌来源的外泌体能否促进原发肿瘤转移至肺脏。

• 从小鼠肺腺癌细胞系LLC中分离出外泌体，并且用纳米颗粒失踪分析来验证分离出来的外泌体。200nm颗粒处浓度最高。蛋白阵列分析证明了已知外泌体表面marker的表达。负电电子显微镜可以看到外泌体茶杯样的形态。脂蛋白在外泌体中也被检测出来。
• 先给实验组小鼠皮下注射LCC-GFP(绿色荧光蛋白)肿瘤细胞，7天后再给实验组和对照组分别注射non-GFP LLC外泌体和肺上皮细胞外泌体，注射7次，打三周。实验组小鼠肺里的LLC-GFP+细胞比例是明显增加的。荧光显微镜也可以看到肺里的微转移灶。
• 共聚焦显微镜分析显示肺组织中的PD-L1与CD11b和F4/80在LLC外泌体治疗组共表达是有所增加的。提示外源性使用TDEs可以提高肺脏中髓系细胞上PD-L1的表达。

• 为了检查这些结果在肺转移的特异性，又用胰腺癌细胞系Pan02的外泌体作为对照，先前报道是首先转移至肝脏的。这个研究的数据提示确实不能转移至肺脏。LLC外泌体治疗的小鼠首先转移至肺脏，而不是肝脏和脾脏。
• 进一步分析在肺髓系细胞上PD-L1的表达情况，LLC外泌体治疗后的确上调了肺间质巨噬细胞（IM）的PD-L1表达，Pan02的外泌体就不行。

这些数据提示TDE的特异亲器官性以及肺细胞上PD-L1上调是LLC外泌体刺激的结果。

为了明确外泌体的分布和细胞对外泌体的摄取情况，

• 用红色荧光标记的LLC和MLE-12外泌体注射小鼠，结果显示在肺内的CD11b+和CD11c+髓系细胞有着最高的摄取率，相对于脾脏和骨髓。尽管CD11c+F4/80+的肺泡巨噬细胞对于MLE-12和LLC的外泌体有着相似的摄取率，但是在肺间质巨噬细胞中对于LLC外泌体的摄取率是明显高于MLE-12的外泌体的。所以提示肺间质巨噬细胞更具外泌体的特异性。
• 与体内的髓系表型类似，在体外用TDEs处理F4/80+腹膜巨噬细胞，其表面的PD-L1表达也是增加的相对于MLE-12外泌体处理或者单独的巨噬细胞。这个结果被western也验证了一遍。共聚焦结果分析也显示腹膜巨噬细胞随着时间对GFP+LLC外泌体的吸收也是增加的。
• 用直接从皮下LLC肿瘤形成的瘤子中分离出来的外泌体，这里面有最少的凋亡细胞，并且证明了有PD-L1的表达增加，因而消除了在体外模型的表型影响。
• 被TDEs刺激而上调巨噬细胞上PD-L1表达是剂量依赖性的，并且不会引起巨噬细胞的死亡。TDE刺激对骨髓来源的巨噬细胞也有类似的效应。
• 活体外用LLC外泌体刺激肺的巨噬细胞，间质巨噬细胞上的PD-L1的表达是上调的，肺泡巨噬细胞没有增加。这与体内的数据是一致。

在三阴性乳腺癌，结肠癌，黑色素瘤细胞系再次验证外泌体可以增加巨噬细胞表面PD-L1的表达。

这些PD-L1的表达增加是如何产生的呢？是外泌体刺激巨噬细胞内源性的PD-L1的合成还是巨噬细胞只是从外泌体中被动获得呢？

• 通过western可以确认LLC和三阴性乳腺癌4T-1细胞的外泌体都表达PD-1。然而，RT-PCR分析显示用LCC外泌体治疗的巨噬细胞中PD-L1的mRNA表达是上升的，用放线菌素D(ACT-D)抑制这种RNA转录可以抹除这种效应。
• 进一步分析巨噬细胞，巨噬细胞+LLC外泌体，LLC外泌体三组的PD-L1的表达，发现外泌体里的PD-L1对于被外泌体刺激后的巨噬细胞表达的PD-L1的贡献是非常少的。

这些数据表明增加的PD-L1的主要机制是重新合成，而不是从外泌体中获得。

以上这些数据可以提示的是LLC TDEs可以选择性的被F4/80+巨噬细胞吸收，尤其是肺IMs，导致内源性的PD-L1的生成增加并且促进原发肿瘤在肺中的转移。

接下来要探索的问题是TDE的刺激是否可以影响巨噬细胞的功能。

• 首先用细胞因子阵列分析了巨噬细胞培养上清液，相较于单独的巨噬细胞和被MLE-12外泌体刺激的巨噬细胞，TDE刺激的巨噬细胞表现出TNF-α，TIMP-1,MCP-1,IL-10,IL-6,IL-1ra，G-CSF和CXCL1细胞因子的增加。显著的是，所有的细胞上清液都没有IFN-γ，因此排除了这个成为PD-L1上调的原因。

• ELISA实验可以明确TDE刺激后IL-6和IL-10产出增加。除此之外还可以增加Arg-1和VEGF的mRNA表达水平。
• 然而，iNOS的急剧增加说明了在肿瘤微环境中的巨噬细胞经常展现一个M1/M2混合的表型。

为了明确TDE刺激的巨噬细胞对效应T细胞的直接效应，

• 研究者用MLE-12和LLC外泌体预处理巨噬细胞，然后与OVA转基因的T细胞共培养。CD8+T细胞在与TDE处理后的巨噬细胞培养后的的确在细胞增殖和IFN-γ产生方面都有了明显的下降。这个现象可以被抗PD-1抗体逆转，提示巨噬细胞表面的PD-L1的表达部分导致了效应T细胞的功能抑制。CD4+T细胞也有相似的表型。

这些数据提示TDE刺激的巨噬细胞通过直接PD-L1途径和细胞因子介导的间接途径来表现为免疫抑制表型。

TDEs途径是通过TLR2（Toll-like receptor）并且诱导了NF-κB途径，导致了巨噬细胞PD-L1的上调。

TLRs在固有免疫中扮演重要角色，并且在哨兵免疫细胞，比如巨噬细胞和树突状细胞中被发现。

• LLC外泌体刺激后PD-L1表达增加的现象在TLR转接蛋白MyD88缺乏的巨噬细胞可以被抹除。

为了明确是哪一种特异的TLR在这个通路中起作用，

• 在分别缺乏TLR2-,TLR4-,TLR6-,TLR7-和TLR-9的小鼠中提取腹膜巨噬细胞，然后再用外泌体刺激，可以看到的是只有TLR2-/-缺乏的巨噬细胞PD-L1表达不增加。其他TLR缺乏小鼠外泌体增强PD-L1的表达与WT类似。
• TDE刺激导致的TNF-α和IL-6生成增加在TLR2-/-小鼠中也被消除了。在其他TLR缺乏的小鼠中还是保留活性的。

为了巩固TLR2对于外泌体介导他们在巨噬细胞上的功能和促进转移前癌灶的形成方面过程中的必要性，

• 用了之前的LLC-GFP皮下注射肿瘤的TLR2-/-小鼠体内模型来继续探索这个问题。在TLR2-/-小鼠中，TDE治疗后的肺中LLC-GFP%与对照组无差异。TLR2-/-小鼠在LLC外泌体治疗后的肺中LLC-GFP%是明显下降的。
• 共聚焦显微镜显示在TLR2-/-小鼠TDE处理后的肺中无癌灶转移。

这些数据表明TLR2途径在TDE介导巨噬细胞PD-L1表达增加和影响原发肿瘤转移至肺中是必要的途径。

研究已经证明PD-L1表达增加与NF-κB通路的激活有关。

• 而且TLR2也可以激活NF-κB通路。LLC的外泌体刺激可以增加NF-κBp65的磷酸化。

• 除此之外，抑制NF-κB可以减少巨噬细胞PD-L1的表达。
• 流式细胞学的结果和RT-PCR的结果都可以验证。
• 另一个影响PD-L1表达的主要通路是雷帕霉素的靶向通路（mTOR通路）。

sLLC外泌体刺激的巨噬细胞在转接蛋白Raptor或者Rictor的缺失并不会导致PD-L1表达的改变，所以提示这条通路并不是关键通路。

接下来进一步要探究的是哪一个特定的外泌体因素激活了TLR2。之前的研究提示饱和的脂肪酸可以激活TLR2通路。

• 在进行了MLE-12和LLC外泌体代谢组学的分析后，结果聚焦在了长链脂肪酸（LCFAs）上。相对于MLE-12外泌体，LLC外泌体中丰度更高的脂肪酸有软脂酸，亚麻油酸（LA），油酸，HODE，二十碳五烯酸(EPA)。于是用这些长链脂肪酸去刺激巨噬细胞，发现只有亚麻油酸可以上调巨噬细胞PD-L1的表达，尽管与TDE刺激下的巨噬细胞PD-L1的水平有一定差距。

另一个已知TLR2配体HMGB-1与NSCLC的淋巴结转移有正向关系。在多种癌症中都会发现HMGB-1是过表达的。

• LLC整个细胞的裂解产物和TDEs都提示HMGB-1有显著的表达。
• LLC外泌体相对于对照组表达更多的HMGB-1，尽管其他的外泌体marker也是差异表达的。用小鼠重组HMGB-1刺激巨噬细胞导致了PD-L1的表达增加。
• 与此相反的是，用rmHMGB-1刺激MyD88-/-和TLR2-/-巨噬细胞发现PD-L1没有变化。

• HMGB-1敲除的LLC细胞提取出的外泌体大幅度地降低了他们诱导PD-L1表达的能力。
• 在原位4T-1小鼠乳腺癌模型中，敲低HMGB-1也能降低HMGB-1在原发肿瘤的中的整体表达同时能相应地降低肺中转移癌灶的数目。

总体来说，这些数据提示肿瘤来源的外泌体HMGB-1是一个主要应对TLR2依赖的PD-L1上调和潜在肿瘤转移的主要因子。

TDE诱导的PD-L1上调是通过代谢重编程来介导的。巨噬细胞用二分类法分成的M1型和M2型。M1型被认为是炎症前细胞，依靠的是糖酵解代谢，M2是肿瘤前细胞，依赖氧化磷酸化途径。这种二分类法是被一些在特定的环境和肿瘤进展过程中既有抗肿瘤又有肿瘤促进作用的巨噬细胞所挑战的。

首先需要探索的是是否代谢改变能够驱动TDE介导的巨噬细胞极化，葡萄糖去除的巨噬细胞和2-NBDG(荧光标记的2-脱氧葡萄糖类似物)共培养来检测葡萄糖的消耗情况。

• TDE刺激的巨噬细胞相对于对照组葡萄糖的摄入的确增加了。糖酵解途径的抑制剂2-DG可以显著下调TDE刺激后的PD-L1的表达，提示糖酵解途径可能是驱动PD-L1表达的因素之一（其实只下调了一部分，作为能量供应的一个途径，必然会下调任何需要能量的过程）。
• 进一步分析代谢酶显示GLUT-1, HIF1-α，LDHA表达都有所增加。PCR和WB的结果都显示PDK1在外泌体刺激组都有所增加，而且HK1在TDEs和对照组没有区别。

葡萄糖的摄入增加伴随着GLUT-1, HIF-1α和LDHA的表达增加提示TDE刺激的巨噬细胞在常氧状态下更倾向糖酵解代谢途径。

• 为了验证这个假设，进一步用一系列的Seahorse试验评估糖酵解和线粒体功能。用糖酵解压力试验，巨噬细胞在LLC外泌体刺激组展示初更高的胞外酸化率。
• 氧气消耗率展示出TDE刺激的巨噬细胞对线粒体抑制剂(寡霉素和FCCP)没有反应。这种效应不是因为过量的TDE治疗引起的。
• 生物能量分析显示出在TDE-处理的巨噬细胞有高水平的非线粒体氧气消耗，提示除了利用氧气的线粒体ATP生产的另一种机制。

• DCFDA染色也显示出TDE刺激的巨噬细胞产生了更少的ROS，排除了ROS途径作为主要氧气消耗的途径。

另一个在肿瘤微环境中可以利用氧气的分子是NO。除了消耗自由氧，NO可以通过干扰激活的呼吸线粒体中的复合物Ⅲ和Ⅳ来抑制电子传递链。

• TDE刺激可以增加胞内NOS2的表达，与之前mRNA的数据一致。利用NOS2抑制剂SEITU可以完全挽救巨噬细胞的氧化呼吸能力，然而减少了糖酵解能力和ECAR。

• 生物能量分析证明恢复ATP合成是剂量依赖性的。 更进一步分析，在TDE刺激的巨噬细胞中使用SEITU可以降低PD-L1的表达，提示TDE诱导的PD-L1表达与糖酵解是正相关，与氧化途径是负相关。 TDE刺激的巨噬细胞NOS2表达是依赖MyD88途径的，但是不依赖HIF1-α，提示NOS2和HIF-1α影响糖酵解是通过两个独立的机制。

为了检验NOS2在体内对于转移前癌灶巨噬细胞和后续肿瘤转移的影响，

• 依然用LLC外泌体给NOS2-/-小鼠注射并且监测肺部的转移肿瘤情况。
• WT小鼠可以表现出与之前相似的结果，LLC外泌体处理组有着更高的肺部肿瘤转移，但是在NOS2-/-小鼠中没有这种差别。肺中IM上PD-L1表达也是相同的情况，WT组中的外泌体处理组有升高，NOS2-/-没有这种差别。

这些体内数据表明NOS2在肿瘤转移中的关键作用，也进一步支持了之前体外的关于TDE诱导PD-L1升高部分是通过NOS2介导的氧化代谢途径抑制来实现的。

HIF1-α在TDE代谢重编程中的作用调查发现TDE诱导的GLUT-1mRNA表达升高的功能可以在HIF-1α-/-巨噬细胞中被消除。

• 在TDE刺激下的PD-L1表达也被显著下调了。
• 除此之外，TDE刺激的HIF-1α和GLUT-1上调也在MyD88-/-巨噬细胞中被抹除了，提示这些因子的确是TLR2通路的下游并且被外泌体配体介导。
• 抑制NF-κB也能降低TDE刺激的HIF-1α表达提示HIF-1α的激活也依靠下游的NF-κB。
• 利用LLC-GFP皮下肿瘤模型，发现了HIF-1α在转移前微环境中介导PD-L1表达。数据显示HIF-1α敲除老鼠肺中IM在LLC外泌体处理后PD-L1表达反应相对于对照组明显下降。

这些数据是支持体内数据得到的结论，提示HIF-1α在驱动PD-L1表达过程中是NOS2的次级角色。

以上数据表明TDE极化巨噬细胞是通过代谢重编程来增加PD-L1表达。特异的是，NF-κB是主要的转录因子，可以利用HIF-1α/GLUT-1给巨噬细胞带来更多的葡萄糖以及带来NOS2/NO来抑制线粒体的氧化磷酸化。氧化代谢产物α-酮戊二酸可以抹除TDE刺激下巨噬细胞的PD-L1的表达增加，进一步强化了糖酵解与PD-L1表达的联系。

TDE诱导的乳酸生成通过NF-κB来使PD-L1表达增加。

经典的温伯格肿瘤代谢标志不仅包括在常氧状态下的糖酵解，也包括丙酮酸从乙酰化辅酶A到乳酸的分流。已经证明TDE极化下的巨噬细胞朝着更高水平的糖酵解表型发展，于是假设在TDE处理过的巨噬细胞中乳酸生成增加了，并且乳酸可能在诱导PD-L1表达中是一个关键的代谢物。

• TDE刺激的巨噬细胞培养基中的乳酸浓度是上升的。巨噬细胞数目增加，乳酸浓度也会增加。增加的乳酸是通过外泌体配体MyD-88和NF-κB通路实现的。在HIF-1α-/-巨噬细胞中乳酸的分泌量显著减少，但是并没有回到基线水平，说明NOS2途径也是会促进乳酸分泌的。乳酸出口单羧酸转运蛋白(MCT4)的mRNA表达也是增加的，可以解释这些细胞分泌乳酸到上清液增多。

接下来想探究的是乳酸是否是糖酵解增多导致PD-L1表达增加的最终下游代谢物。

• 乳酸刺激巨噬细胞可以增加PD-L1的表达。用AZD3962特异性的抑制乳酸转运蛋白MCT1可以消除乳酸诱导的PD-L1上调作用。
• 静态磷物质流分析模型（Phosflow）揭示了乳酸在15min和30min诱导了NF-κBp65蛋白的磷酸化。
• 共聚焦显微镜再次验证这些结果显示NF-κBp65在乳酸刺激后转运至核内的峰值在30min而在1h后又退回胞质。

• 流式细胞计数分析乳酸诱导的PD-L1表达是NF-κB依赖性的。
• RT-PCR的结果重复了这个发现。RT-PCR分析也发现乳酸输入蛋白MCT1在TDE的刺激后也增加了，提示胞外和胞内的乳酸都驱动了这个表型。

以上这些数据展示了在驱动PD-L1表达方面乳酸的新作用。

具体的说，TDE信号激活了NF-κB以及它的下游效应分子NOS2和HIF-1α，增加了糖酵解代谢途径，并且使丙酮酸分流成乳酸。新和成的乳酸再反馈调节NF-κB，更进一步增加PD-L1的表达并且维持和增强糖酵解表型。

TDE在体内转移前微环境形成中的作用

接下来想确认的是在体内组织常驻的巨噬细胞也在TDE刺激后能够增强糖酵解表型。

• 于是给WT小鼠2周内每3天注射LLC或MLE-12外泌体。最后一次处理1天后，腹腔注射18F-氟脱氧葡萄糖（FDG）。临床上讲，18F-FDG正电子发射断层扫描是NSCLC病损的重要图像检查，18F-FDG摄取增加与肿瘤PD-L1表达增加有关。在注射18F-FDG1h后，小鼠被安乐死，测量整个肺的放射性发现两个处理组之间没有差别。但是从TDE处理过的小鼠肺里富集巨噬细胞部分显示出明显的18F-FDG摄入增加。
• 更进一步的分析显示，富集的巨噬细胞部分在TDE组有着更高的PD-L1, HIF-1α和MCT-4表达。

这些数据验证了体外的结论，TDE刺激导致了巨噬细胞糖酵解途径的强化，然后驱动了PD-L1的上调。

接下来要探究的是TDE驱动的表型是如何影响体内转移前微环境的免疫景观的。

• HE染色确认了肺在终点时无明显的原发肿瘤转移灶。
• 分析IM和AM细胞群，可以发现IM细胞群在肿瘤负荷小鼠里有明显的增高，然而AM没有什么变化。
• 进一步分析，IM细胞群在转移肿瘤微环境中PD-L1表达增加。AM细胞群并无变化。其他在肿瘤负荷小鼠肺中明显的效应有单核细胞的下降和MDSCs的上升。

接下来要证明的是TDEs特异性地介导了在IM部分的PD-L1表达的上升使得肺癌转移的启动。

• 为了解决这个问题，使用了CRISPR/Cas9技术编辑了RAB27a基因，这是一个在4T-1乳腺癌细胞中外泌体分泌的关键调控蛋白。鉴于乳腺癌，尤其是三阴性乳腺癌经常转移至肺脏，将一个三阴性4T-1原位乳腺癌有着肺转移小鼠作为临床相关模型。
• WB分析显示转染后Rab27a表达有了50%的下降。在干扰对照组和Rab27-/-组的整体原发肿瘤负荷之间没有明显的差别。
• 然而，肺中CCR2- IM细胞群在外泌体肿瘤组有扩张趋势，而在RAB27-/-肿瘤组减少了。

• 更进一步的说，RAB27敲除减少了在CCR2- IM分隔区PD-L1的表达而CCR2+ 未改变。AM分隔区在RAB27删除后没有明显的改变。

这些数据提示TDE特异性的影响组织常住的IM在肿瘤转移前微环境中PD-L1的表达。

• 在RAB27删除后的肺中总体免疫景观证明了总体更为活跃的免疫状况。MDSCs比例下降，CD8+T细胞比例上升，PD-1表达下降。与此相反的是，在RAB27-/-肿瘤负荷小鼠中CD4+ T细胞的比例没变，但是PD-1的表达有明显的下降。

以上这些数据说明从原发肿瘤来源的循环外泌体可以转移至肺部并且可以增加组织居住的IM细胞的PD-L1表达，诱导PD-1+T细胞的增加以及招募MDSCs到转移前微环境。

人类NSCLC外泌体改变了CD14+巨噬细胞的代谢并且使淋巴结（LNs）为转移做好了准备

为了确定之前结论的临床相关性，

• 用人肿瘤细胞源性的外泌体重现之前的表型。从人类NSCLC A549细胞系分离出的外泌体可以增加CD14+单核细胞上的PD-L1表达。人乳腺癌MCF7和胰腺导管腺癌 S2-013细胞系有类似的效应。
• TDE处理后的CD14+细胞与自体CD3+T细胞共培养证明A549 TDE极化后的CD14+细胞强烈的抑制了CD4和CD8T细胞的增殖以及CD8+T细胞IFN-γ的产出。
• 用重组人HMGB-1刺激可以增加CD14+细胞上PD-L1的表达。
• 用TLR2 阻断抗体可以减少PD-L1的表达，提示人TDEs也是通过TLR2来驱动PD-L1表达的。
• 抑制NF-κB也能减低在TDE刺激后的CD14+细胞上PD-L1的表达。
• 代谢改变研究证明了在A549外泌体处理后通过2-DG抑制糖酵解减低了PD-L1的表达。
• 流式细胞计数分析在TDE刺激后GLUT-1表达增加。乳酸分泌是TLR2途径依赖的。
• 同样地，用外源性乳酸刺激可以通过NF-κB途径增加PD-L1的表达。

总体来说，这些数据提示人TDEs代谢重排了CD14+单核细胞是通过和小鼠模型中相同的代谢机制来完成的。

为了进一步检查临床前模型如何与临床结果相关，通过从NSCLC病人中获取肿瘤浸润阴性的引流淋巴结，来模仿一个肿瘤转移前微环境。比较这些淋巴结和从健康捐赠者的肺淋巴结。

• 总体分析表面marker在髓系细胞中的表达显示CD16+, CD33+, CD63+, CD68+和CD206+, 提示病人样本中的经典M2表型细胞有整体的激活。
• 更进一步，当特异性的观察CD206和PD-L1共表达在CD68+巨噬细胞上，在NSCLC队列中表达量是健康组的两倍。在NSCLC引流的淋巴结中DCs也表达PD-L1，即使CD206+巨噬细胞有高比例的PD-L1表达。
• 显著的是，在引流淋巴结中巨噬细胞上CD206/PD-L1共表达与CD8+T细胞上的PD-1表达正相关。
• 结合免疫表型marker一起，在淋巴结中的髓系和T细胞的主成分分析（PCA）证明了在NSCLC病人和健康者之间平均表达模式的显著差异。

接下来要研究是否在dLNs中巨噬细胞也经历了类似的代谢重排。

• 把CD68+巨噬细胞分成两组，CD206hiPD-L1hi和CD206loPD-L1lo两组，然后测量GLUT-1表达。CD206hiPD-L1hi组确实有GLUT-1的高表达。

• 显著地，鉴于小的样本量，在CD68+细胞上GLUT-1的表达与CD206/PD-L1表达正相关。

总体来说，这些数据提示尽管LN在阴性阶段，但是其局部的髓系和T细胞群已经发生了动态变化，也许是为了为转移癌细胞的到来做准备。

然而，是否这些dLNs中免疫和代谢的变化与来自原发肿瘤外泌体的表型相关仍是一个问题。

• 为了解决这一问题，用TCGA数据库去找是否外泌体的释放基因和淋巴结的转移相关。将病人基于淋巴结的分期分为两组：NX/N0被认为是阴性，而N1-N3被认为是转移阳性。筛查显示两个外泌体释放基因，YKT6和TSG101基因在有阳性淋巴结转移的肺腺癌的原发肿瘤中，相对于阴性淋巴结，表达更高。类似的YKT6表型在结肠腺癌中也可以看到。高表达YKT6的上1/4病人相对于表达低的下1/4病人有着更差的预后。

为了明确YKT6基因表达与外泌体的释放相关，

• 用GFP标记的YKT6基因质粒或者GFP单独的质粒转染A549肺癌细胞系。转染的A549细胞系展示出相似的绿色荧光密度。
• WB显示用GFP-YKT6转染的A549细胞系表达了GFP-YKT6融合蛋白。有趣的是，内源性的YKT6水平也增高了。
• 然后在这些转染细胞中提取了外泌体，纳米颗粒示踪分析提示用GFP-YKT6转染的A549细胞系分泌出了5倍于单独用GFP转染的细胞系的外泌体。

• 再用NSCLC病人队列进行研究发现，CD45-肿瘤细胞相对于从原发肿瘤分离出的CD45+细胞YKT6和TSG101表达是增加的。
• 更进一步，在原发肿瘤细胞上YKT6表达与在dLN上的PD-L1表达是有正相关关系的。
• TSG101也展示出类似的正相关关系。
• 基于队列中NSCLC病人淋巴结内PD-L1的表达情况分组（高大于10%CD68+CD206+PD-L+和低小于10%CD68+CD206+PD-L+）证明了在PD-L1高表达组原发肿瘤中YKTmRNA的水平是增高的。

这些结果至少提示了NSCLC病人队列在原发肿瘤释放外泌体和淋巴结中髓系及T细胞免疫抑制景观之间是存在正向关系的。