不同海拔地区高血压患者Hcy水平及代谢酶基因多态性与血压及氧化应激水平的关系研究
近年来高血压的发病率不断升高，已影响全球超过15亿人，增加了心力衰竭、冠心病等心血管疾病的发生风险［1］。原发性高血压患者中约75％伴血清同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平升高，称为H型高血压［2］。亚甲基四氢叶酸还原酶（5，10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）C677T、A1298C及蛋氨酸合酶还原酶（methionine synthase reductase，MTRR）A66G为Hcy代谢关键酶，该酶基因型突变会显著影响Hcy水平。高海拔可增强体内氧化应激及Hcy水平，影响MTHFR及MTRR基因多态性频率，高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia，HHcy）是心血管疾病的危险因素之一，亦会增强人体内氧化应激水平、升高血压。目前关于Hcy代谢关键酶不同基因型是否对Hcy、血压、氧化应激水平产生影响尚不明确，Hcy与血压、氧化应激水平是否存在相关性尚无定论。本文旨在分析海拔对MTHFR、MTRR基因多态性频率的影响，比较Hcy代谢关键酶不同基因型之间Hcy、血压、氧化应激水平差异，同时探索Hcy、血压、氧化应激水平之间是否存在相关性。
1 对象与方法
1.1 研究对象
纳入2023年7月—2024年7月在青海大学附属医院诊治的玉树地区（海拔3 800~4 200 m）高血压患者60例（高海拔高血压组）、健康受试者30例（高海拔健康组）；纳入同期诊治的西宁地区（海拔2 260 m）高血压患者60例（低海拔高血压组）、健康受试者30例（低海拔健康组）为研究对象。
纳入标准：（1）高血压患者符合《中国高血压防治指南（2024年修订版）》［3］诊断标准；（2）年龄18~75岁；（3）研究对象为世居者（当地生活3代以上）或移居者（在当地生活10年以上）。排除标准：（1）继发性高血压、冠心病、糖尿病及其他系统疾病；（2）BMI≥28.0 kg/m2或<18.5 kg/m2；（3）妊娠期或哺乳期妇女；（4）近3个月内服用过影响Hcy水平的药物，如叶酸、维生素B6、维生素B12等。
本研究经青海大学附属医院伦理委员会批准（伦理号：P-SL-2023-290）、中国人类遗传资源采集许可［国科人遗审字（2023）CJ0216号］。向研究对象仔细解释研究目的和程序，并取得每位参与者的书面知情同意书。
1.2 研究方法
1.2.1 问卷调查和人体测量：所有受试者填写基本信息的调查问卷，完成人体测量，包括性别、年龄、BMI、血压、吸烟史（吸烟定义为患者自入院治疗前10年内曾经有规律的吸烟，且吸烟数量累计≥100支）、饮酒史（饮酒定义为患者自本次入院接受治疗前曾经有规律的饮酒）、用药史、高血压家族史等。身高精确到0.1 cm，体质量精确到0.1 kg。血压测量前要求患者安静休息30 min，然后使用UA-779数字监护仪测量3次收缩压（SBP）和舒张压（DBP），结果取2次平均值。
1.2.2 血液样本采集和实验室检测：受试者禁食8 h后，于次日7：00 am行静脉采血。取5 mL静脉血离心（转速3 000 r/min，离心半径10 cm，离心时间10 min）分离血清，于-80℃冰箱内保存，统一在青海大学附属医院中心实验室采用微量酶标法测定血清氧化型谷胱甘肽（glutathione oxidized，GSSG）、一步法测定血清一氧化氮（nitric oxide，NO）、酶联免疫吸附试验法测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）水平。检测Hcy水平，并根据《中国高血压防治指南（2018年修订版）》［4］，HHcy定义为血浆Hcy≥15 μmol/L，最终120例高血压患者中74例非HHcy，46例HHcy。
1.2.3 DNA提取和基因分型：晨起空腹采肘静脉血2 mL，加入EDTA抗凝，立即置于4℃冰箱中，在1 h内离心3 500 r/min，离心半径20 cm，10 min。采用血液基因组DNA提取试剂盒（FAH2401001，中国深圳）提取基因组DNA，并于-20℃保存。使用MTHFR和MTRR基因多态位点检测试剂盒（PCR-荧光探针熔解法）进行基因分析。取2 mL静脉血，EDTA-K2抗凝，采用微量样品基因组DNA提取试剂盒（深圳市亿立方生物技术有限公司，粤深械备20140012号）提取核酸，对基因多态位点进行扩增，扩增参数如下，95℃，180 s；95℃，20 s，60℃，50 s，72℃，40 s，45个循环；72℃，300 s；95℃，120 s；40℃，180 s；40℃~85℃，升温熔解曲线分析。试验结果解释如下，（1）FAM荧光为677位点，熔解曲线峰在≤57℃时，为677CC正常型；熔解曲线峰在≥63℃时，为677TT突变型；有前述两个熔解曲线峰时，为677CT杂合型。（2）Cy5荧光为1298位点，熔解曲线峰在≤53℃时，为1298AA正常型；熔解曲线峰在≥62℃时，为1298CC突变型；有前述两个熔解曲线峰时，为1298AC杂合型。（3）ROX荧光为66位点，熔解曲线峰在≤54℃时，为66AA正常型；熔解曲线峰在≥59℃时，为66GG突变型；有前述两个熔解曲线峰时，为66AG杂合型。（4）临床样品的任何一个荧光通道，不符合上述类型之一时，为该样品试验失败，重新检测。
1.3 统计学方法
采用SPSS 23.0统计学软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料采用例（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用Pearson相关性分析探讨Hcy、血压、GSSG、NO、SOD水平的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 受试者基线资料
各组受试者年龄、性别、BMI、吸烟史、饮酒史、服药史、高血压家族史、民族比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
2.2 受试者血压与实验室检查结果
各组受试者Hcy、收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、GSSG、NO、SOD比较，差异有统计学意义（P<0.05）。组间两两比较结果显示，高海拔高血压组Hcy、SBP、DBP、GSSG高于高海拔健康组、低海拔高血压组，NO、SOD低于高海拔健康组、低海拔高血压组，差异有统计学意义（P<0.05）；高海拔健康组SBP、DBP、GSSG高于低海拔健康组，SOD低于低海拔健康组，差异有统计学意义（P<0.05）；低海拔高血压组Hcy、SBP、DBP、GSSG高于低海拔健康组，SOD低于低海拔健康组，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.3 不同海拔地区受试者基因型频率比较结果
不同海拔地区高血压组受试者MTHFR C677T基因型频率比较，差异有统计学意义（P<0.05），MTHFR A1298C、MTRR A66G基因型频率比较，差异无统计学意义（P>0.05）；不同海拔地区健康组受试者MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRR A66G基因型频率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
Hardy-Weinberg平衡分析结果显示，不同海拔地区高血压组和健康组受试者的基因多态性均无偏差（P>0.05）。
2.4 高血压受试者不同基因多态性血压与实验室检查结果比较
120例高血压患者MTHFR C677T位点中CC基因型56例（46.67%），CT基因型43例（35.83%），TT基因型21例（17.5%），MTHFR A1298C位点中AA基因型62例（51.67%）、AC基因型51例（42.50%）、CC基因型7例（5.83%），MTRR A66G位点中AA基因型62例（51.67%）、AG基因型48例（40.00%）、GG基因型10例（8.33%）。MTHFR C677T位点中TT基因型Hcy、SBP、NO、SOD水平高于CT基因型和CC基因型，GSSG低于CT基因型和CC基因型，CT基因型Hcy、SBP、NO、SOD水平高于CC基因型，GSSG低于CC基因型，差异有统计学意义（P<0.05）；3种基因型DBP、HHcy、SBP≥140 mmHg、DBP≥90 mmHg比例比较，差异无统计学意义（P>0.05）；MTHFR A1298C位点中CC基因型Hcy水平、HHcy比例高于AC基因型和AA基因型，AC基因型Hcy水平、HHcy比例高于AA基因型，差异有统计学意义（P<0.05）；3种基因型SBP、DBP、GSSG、NO、SOD、SBP≥140 mmHg、DBP≥90 mmHg比例比较，差异无统计学意义（P>0.05）；MTRR A66G位点中GG基因型Hcy、NO、HHcy比例高于CC基因型和CT基因型，CT基因型Hcy、NO、HHcy比例高于CC基因型，差异有统计学意义（P<0.05）；3种基因型SBP、DBP、GSSG、SOD、SBP≥140 mmHg、DBP≥90 mmHg比例比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
2.5 非HHcy患者与HHcy患者血压与实验室检查结果比较
HHcy患者DBP、GSSG高于非HHcy患者，NO、SOD低于非HHcy患者，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.6 高血压受试者血压、Hcy、氧化应激指标的相关性分析
相关性分析结果表明，高血压受试者Hcy与DBP、GSSG水平呈正相关，与NO、SOD水平呈负相关，NO与DBP水平呈负相关（P<0.05）。
3 讨论
Hcy为蛋氨酸转化为半胱氨酸过程的中产物［5］，蛋氨酸在转移酶的作用下转化为S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM），SAM去甲基化生成S-腺苷同型半胱氨酸，后水解生成Hcy［6］。Hcy一方面通过转硫途径去除，另一方面在蛋氨酸合酶的作用下再甲基化为蛋氨酸去除［7］，再甲基化途径以5-甲基四氢叶酸为底物、维生素B12为蛋氨酸合酶的辅助因子［8］，MTHFR可催化5，10-亚甲基四氢叶酸转换成5-甲基四氢叶酸，MTRR可将5-甲基四氢叶酸转化为四氢叶酸［9］，在这个过程中，Hcy代谢与细胞内叶酸代谢产生交联，这也是叶酸水平影响Hcy代谢的重要原因。叶酸属水溶性B族维生素，人体不能合成，需从绿色蔬菜中摄取，而高海拔地区人群由于饮食结构中绿叶蔬菜摄入不足，缺乏叶酸及维生素，易导致Hcy代谢受阻在体内蓄积形成HHcy。研究显示，高海拔地区HHcy及高血压的患病率高于低海拔地区［10］，血压水平随海拔的升高而升高［11］。本研究结果显示，纳入的120例患者中仅有46例（38.3%）患者为HHcy，高海拔的玉树地区高血压组及健康对照组血压水平及Hcy水平均高于西宁地区，与上述研究结果较为一致。
高海拔低氧环境会诱导机体产生大量氧自由基，升高机体内氧化水平、降低抗氧化能力，破坏人体内氧化平衡，加剧氧化应激水平［12］。随着海拔高度的增加、大气压的降低，人体细胞和组织内不断降低的氧分压会加剧线粒体、黄嘌呤氧化还原酶、细胞色素P450依赖的微粒体电子传递系统产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），氧化应激水平会随海拔的升高而加剧［13］。SOLIMAN等［14］进行的实验表明高海拔环境会降低大鼠体内SOD水平，本研究发现玉树地区人群体内氧化物GSSG及NO水平高于西宁地区、SOD水平低于西宁地区结论与之一致，而长期暴露于高海拔低氧环境会升高人体内氧化水平、降低抗氧化水平［13］。为了分析海拔对血压、氧化应激水平的影响，本研究对两地健康组进行比较，结果发现玉树地区血压、GSSG水平高于西宁地区，SOD水平低于西宁地区，表明海拔升高可增加血压、氧化应激水平。
目前研究表明，海拔可能影响MTHFR C677T、MTRR A66G基因型频率，但尚无确切结论。YANG等［15］研究发现高海拔环境下MTHFRC677T位点的TT型等位基因频率低于低海拔地区；REYES等［16］分析了C677T基因多态性在墨西哥和中美洲人群中的分布，结果显示T等位基因的频率从东南到西北，随海拔水平的升高而降低。而YANG等［15］分析发现高海拔人群体内MTHFR 677 T等位基因的频率高于C等位基因。本研究结果显示，高血压组MTHFR C677T基因多态型在西宁地区以突变型（CT、TT型）为主，玉树地区以野生型（CC型）为主且TT基因型频率低于西宁地区（P=0.04）。格桑平措等［17］的研究发现，低海拔地区（河南、山西等）基因型频率占比均低于高海拔地区（西藏），与其不同的是，本研究结果显示两地区高血压组MTHFR A1298C、MTRR 66 GG基因型频率差异无统计学意义（P>0.05）。此外，本研究比较两地区健康对照组MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRRA66G基因型频率未发现具统计学差异（P>0.05），并未发现海拔对基因多态性频率产生明显影响。高海拔地区人群可能出于对环境适应的原因会产生基因型频率的改变，但基因型频率差异与海拔的关系仍需更多研究来探索。
MTHFR、MTRR均为Hcy代谢途径关键酶，C677T基因型中T取代C、A1298C基因型中C取代A、A66G基因型中G取代A均会影响酶活性进而升高人体内Hcy水平［18-19］。SIDDIQI等［20］的研究表明MTHFR C677T和A1298C多态性与血清Hcy水平升高之间存在显著关联，677位点的TT型和1298位点的CC型具更高Hcy水平，相反MTRR A66G基因型与Hcy水平无显著相关性。与此结论不同，MAZOKOPAKIS等［21］研究表明MTHFR 677 TT基因型血清Hcy水平显著高于CC或CT基因型，但MTHFR A1298C基因多态性与Hcy水平无相关性。在分析不同基因型对Hcy水平的影响中，本研究结果显示C677T、A1298C、A66G三种基因多态性之间Hcy水平差异具有统计学意义，纯和突变型>杂合突变型，杂合突变型>野生型（P<0.05）；同时发现在A1298C、A66G基因型中HHcy主要集中于杂合突变基因型（AC型、AG型）（P<0.001）。本研究结论与目前研究结果一致的是677TT基因型可升高Hcy水平，而不同的是A1298C、A66G基因多态性亦对Hcy水平产生了影响。MTHFR A1298C不会影响Hcy水平可能与基因突变在影响MTHFR活性的同时并不会导致不耐热蛋白的形成（MTHFR基因突变会降低酶的耐热性）有关［21］，因此探索MTHFR A1298C基因多态性对Hcy水平的影响似乎是无意义的，与此结论相悖的是SIDDIQI等［20］的研究与本研究均发现A1298C基因型突变可对Hcy水平产生影响，因此MTHFR A1298C与Hcy水平的关系仍需进一步研究。
HHcy可致血管内皮舒张功能减退，进一步加剧高血压的发生、发展［22］。本研究进一步探讨了Hcy代谢的关键酶MTHFR、MTRR不同基因型患者之间血压水平的差异，结果表明，高血压组MTHFR C677T不同基因型患者之间SBP水平存在差异，TT基因型SBP水平>CT型>CC型（P=0.04），即突变基因型可能具有更高水平的SBP，但C677T不同基因型之间高SBP发生率的差异无统计学意义（P>0.05）。YUAN等［23］研究表明，携带MTHFR 667TT的患者有更高的高DBP发生率，携带MTRR 66GG的患者有更高的高SBP发生率。本研究未发现MTHFR A1298C、MTRR A66G不同基因型对血压的影响。
Hcy水平在升高血压的同时亦会增强高血压患者体内氧化应激水平［24-25］，MTHFR、MTRR基因多态性可对Hcy、血压水平产生影响，本研究进一步分析了不同基因型与氧化应激水平的关系，结果表明，TT型GSSG水平低于CT型，CT型GSSG水平低于CC型，同时TT型SOD水平高于CT型，CT型SOD水平高于CC型，即C677T基因型突变（CT、TT基因型）会降低氧化、升高抗氧化水平，从而降低氧化应激水平。而WANG等［26］分析MTHFR遗传多态性与氧化应激生物标志物的关系，发现携带MTHFR 677 CC基因型受试者具有较高的红细胞SOD活性，增强抗氧化应激能力，降低氧化应激水平。除此之外，本研究及既往研究并未发现MTHFR A1298C、MTRR A66G不同基因型之间存在氧化应激水平差异。
研究表明，HHcy可通过减少抗氧化生物标志物SOD的分泌来干扰抗氧化防御系统，最终导致氧化应激和细胞损伤［27］。在H型高血压的发病过程中，肾素-血管紧张素-醛固酮系统的激活及HHcy会增加ROS的产生，升高氧化应激水平［28］。HHcy可能加剧H型高血压的严重程度。因此本研究分析了H型高血压发病过程中Hcy水平对氧化应激水平的影响，结果发现HHcy高血压患者GSSG及DBP水平高于非HHcy患者（P=0.038、0.025）、SOD水平低于非HHcy患者（P=0.011），说明Hcy水平可能会升高氧化水平、降低抗氧化能力。本研究进一步分析了Hcy、氧化应激水平之间是否存在相关性，结果显示Hcy水平与DBP、GSSG水平呈正相关关系，Hcy水平与SOD水平呈负相关关系。
海拔升高与基因突变均会升高血压、Hcy水平，同时Hcy水平升高亦会使血压、氧化应激水平升高。一方面高海拔环境氧化应激水平升高可能是由于突变型基因频率的降低，另一方面矛盾的是，高海拔在升高血压、Hcy水平的同时降低突变基因型频率会降低HHcy的发生率，但从本研究结果来看，两地区只有高血压组MTHFG C677T基因型频率存在差异，健康对照组并未存在基因型频率差异，海拔对基因型频率是否产生影响仍不明确，目前关于Hcy代谢酶基因多态性与Hcy、血压水平的关系尚不明确，仍需更多探索。
总之，高海拔地区趋向于过氧化应激，可加剧H型高血压的发生、发展。目前个体化基因检测已经逐渐普及，未来对不同海拔地区、基因型针对性使用降Hcy、抗氧化应激药物可能是H型高血压个体化药物治疗的新靶点。
参考文献略
