细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E1基因多态性及其交互作用与先兆子痫的关联研究
先兆子痫（preeclampsia，PE）是一种严重威胁母婴健康的多系统疾病，其特征是妊娠20周后出现高血压伴蛋白尿或其他终末器官功能障碍［1］。我国PE的发病率为4%~5%［2］。据估计，PE每年可导致全球超过6万例孕产妇死亡和超过50万例早产的发生［3］。除死亡风险外，PE孕妇中胎盘早剥、弥散性血管内凝血等严重并发症的发生风险也显著增加。然而，目前除终止妊娠外，尚无其他有效的治疗方法［4-5］。开展PE病因学及危险因素的研究对于降低疾病发生风险、改善患者预后具有重要意义。
研究表明，“两阶段模型”在PE的发展中发挥重要作用［6］。其中，第一阶段涉及滋养层细胞增殖、分化与侵袭异常，可导致血管重塑障碍及胎盘血供减少，从而引发一定程度的缺血缺氧。在此环境中，胎盘滋养层分泌抗血管生成因子，如可溶性酪氨酸激酶1（sFlt-1）和可溶性内皮因子（sEng）。第二阶段涉及血清sFlt-1和sEng持续升高，引起血管内皮功能障碍和缺氧/缺血恶化，最终引发PE［7-9］。
细胞周期是细胞增殖的重要环节，可分为间期和有丝分裂期（M期），间期包括G1期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）和G2期（DNA合成后期）［10］。G1-S期和G2-M期的转换是细胞周期调控的关键节点，这两个阶段的分子水平变化较为活跃，易受到外界因素的影响。而细胞周期蛋白D1（CCND1）和细胞周期蛋白E1（CCNE1）基因在调节细胞周期从G1期到S期的进展中发挥着重要的作用。研究表明，这两个基因通过影响滋养层细胞的迁移和侵袭能力，从而导致胎盘功能异常［11-12］。然而，目前缺少关于CCND1和CCNE1基因多态性与PE易感性的关联研究。开展这方面的研究将有助于早期预测和识别PE的高风险人群。
PE作为一种复杂的疾病，其发生不是单个基因的作用，基因-基因间的交互作用在PE的发展中亦至关重要。因此，本研究旨在探索CCND1和CCNE1基因多态性及其交互作用与PE易感性之间的关联，为PE病因学研究提供科学依据。
1 对象与方法
1.1 研究对象
选取2020年10月—2023年10月在中南大学湘雅三医院和湖南省妇幼保健院产科就诊的孕妇。符合纳入、排除标准的PE孕妇作为病例组，以同期在该院产检且血压正常的孕产妇作为对照组。研究对象均知情同意。本研究经中南大学湘雅公共卫生学院伦理委员会审查通过（编号：XYGW-2019-020号）。
病例组纳入标准：（1）由产科专科医师依据中华医学会妇产科学分会妊娠期高血压疾病学组编制的《妊娠期高血压疾病诊治指南（2020）》［13］明确诊断PE的孕产妇；（2）病例间无亲缘关系；（3）经项目告知后，自愿加入研究并签署知情同意书。排除标准：（1）既往患有高血压、心血管系统疾病或可能导致高血压发生的疾病（如肾上腺功能亢进等）；（2）非自然受孕的孕妇；（3）多胎妊娠；（4）因各种原因无法提供血液样本或未完成问卷调查者。
对照组纳入标准：（1）依据《妊娠期高血压疾病诊治指南（2020）》明确诊断不患PE或妊娠期高血压其他亚型的孕产妇；（2）彼此间无亲缘关系；（3）经项目告知后，自愿加入研究并签署知情同意书。排除标准同病例组。
1.2 人口学资料及生物样本数据收集
人口学资料采用面对面问卷调查的方式进行收集，包括：孕产妇基本资料（年龄、文化程度、孕前BMI及家庭平均年收入）；孕产妇产科及生育史情况（孕次、产次、不良妊娠史、妊娠并发症史、计划妊娠、家族高血压史）；围生期环境因素暴露（吸烟、二手烟暴露、孕早期饮酒、孕早期饮茶、居住地附近环境污染物、家庭房屋装修、CT/X线接触及服用叶酸情况）。所有研究对象在入组后24 h内，使用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝管采集外周静脉血3~5 mL。
1.3 候选基因的选择与确认
本研究候选基因为CCND1和CCNE1基因，通过NCBI的dbSNP数据库（ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/ ）及1000Genomes数据库（ https://asia.ensembl.org/index.html ）查找并筛选候选基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点，以MAF in Asian & CHS≥5%为常见变异。应用Haploview软件对2个基因合计22个基因位点在对照组中基因型分布进行Hardy-Weinberg平衡检验，以P>0.05为符合Hardy-Weinberg平衡的判定标准，最终纳入2个基因14个位点：CCND1（rs1352075、rs9344、rs602652、rs7177、rs3212891、rs586459、rs647451、rs678653、rs2510467），CCNE1（rs1406、rs3218035、rs3218038、rs3218070、rs3218076）。
1.4 基因多态性检测
本研究在实验室检测中使用MassARRAY飞行质谱检测系统进行基因分型。首先进行PCR扩增含有SNP位点的DNA序列，然后利用特异性单碱基延伸引物扩增PCR产物。在ddNTP反应体系中，延伸引物只在与待检测SNP位点互补的碱基处扩增并终止。最终延伸产物通过飞行时间质谱系统进行分析，根据不同碱基的分子量差异对SNP进行分型。基因分型工作由博淼生物科技（北京）有限公司完成。
1.5 统计学处理
采用EpiData 3.0软件建立数据库，双人交叉录入所有调查问卷数据。所有统计分析基于SPSS 26.0和R Studio v4.2.1软件进行。计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验或Fisher's确切概率法。使用单因素和多因素Logistic回归分析模型分析各基因位点与PE的易感性关联。风险以优势比（OR）和95%置信区间（95%CI）表示。如无特殊说明，所有假设检验以P<0.05为差异有统计学意义。使用3DSNP数据库对SNP位点进行功能注释，以评估其生物学功能。采用叉生分析对候选基因的相加交互作用开展研究，以综合分析基因-基因交互作用在PE发展中的影响。
2 结果
2.1 病例组和对照组基本情况比较
共纳入602例研究对象，其中病例组202例，对照组400例。病例组和对照组妊娠时年龄、文化程度、孕前BMI、妊娠并发症史、孕早期饮茶和围生期二手烟暴露比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.2 候选基因与PE的关联分析结果
以基因型为自变量，以是否发生PE为因变量（赋值：未发生=0，发生=1）进行单因素和多因素Logistic回归分析。在多因素Logistic回归分析中，妊娠年龄、文化程度、孕前BMI、妊娠并发症史、孕早期饮茶和围生期二手烟暴露作为调整变量。
对于CCND1 rs1352075位点，单因素Logistic回归分析结果显示，该位点的显性模型（OR=0.40，95%CI=0.20~0.81）和加性模型（OR=0.75，95%CI=0.57~0.99）均可降低PE的风险（P<0.05）。多因素Logistic回归分析结果显示，携带CT/TT基因型孕妇发生PE的风险比CC基因型低（显性模型：aOR=0.44，95%CI=0.20~0.96，P<0.05）。单因素和多因素Logistic回归分析未发现rs9344、rs602652、rs7177、rs3212891、rs586459、rs647451、rs678653、rs2510467位点基因型与PE发生存在关联（P>0.05）。
对于CCNE1 rs3218070位点，单因素Logistic回归分析结果显示，该位点的隐性模型（OR=4.08，95%CI=1.21~13.72）可增加PE的风险（P<0.05）。多因素Logistic回归分析结果显示，携带GG基因型孕妇发生PE的风险比CC/GC基因型高（隐性模型：aOR=4.31，95%CI=1.16~16.04，P<0.05）。单因素和多因素Logistic回归分析未发现rs1406、rs3218035、rs3218038、rs3218076位点基因型与PE发生存在关联（P>0.05）。
2.3 3DSNP数据库功能注释结果
利用3DSNP在线数据库，对候选SNP位点进行多方面的功能评估，包括基因的3D交互作用、增强子和启动子状态、转录因子结合位点、Motif改变以及进化保守性。通过构建六维雷达功能图，全面了解这些位点的功能特征。结果显示：CCND1 rs1352075总评分为110.92，其中启动子评分最高（100），其次分别是转录因子评分（8.99）、保守性评分（0.73）、增强子评分（0.54）和Motif评分（0.53），提示该位点主要通过影响启动子调控CCND1基因的表达；CCNE1 rs3218070的Motif评分为1.05，保守性评分为0.32，提示该位点主要通过影响转录因子结合位点的序列模式，参与CCNE1基因的表达调控。
CCND1 rs1352075位点潜在靶细胞类型/亚型包括：血管内皮细胞（20.51%）、基质细胞（7.30%）、视网膜祖细胞和穆勒胶质细胞（6.74%）等；CCNE1 rs3218070发挥功能的潜在靶细胞类型/亚型包括：血管内皮细胞（14.10%）、绒毛外滋养层细胞（8.98%）、基质细胞（7.69%）等，具体图见附件（附件请扫描文章首页二维码查看）。由此可以发现候选SNP位点的染色质开放区域中，与血管以及胎盘形成相关的细胞调控因子结合位点较多，可能存在重要调控作用。
2.4 基因-基因交互作用与PE易感性关联
本研究采用叉生分析法对候选基因位点间的相加交互作用与PE的关联进行分析。以人口学特征分析中存在统计学差异的变量与PE发生风险相关的潜在环境混杂因素作为协变量，具体包括：妊娠年龄、文化程度、孕前BMI、妊娠并发症史、孕早期饮茶和围生期二手烟暴露。最终纳入SNP位点为：CCND1 rs1352075和CCNE1 rs3218070。研究结果显示，在控制混杂因素后并未发现rs1352075和rs3218070位点间存在相加交互作用。
3 讨论
本研究通过评估CCND1和CCNE1基因共14个位点与PE的发生风险，结果发现，CCND1 rs1352075位点携带CC基因型和CCNE1 rs3218070位点携带GG基因型可能与PE发生风险升高有关。这一发现可以为PE病因学研究提供科学依据，有助于PE的预防及高危人群的早期识别，对于降低PE的发病率、减少PE相关疾病负担、提升母婴健康水平具有重要意义。
CCND1基因是细胞周期启动的起始因子，也是生长因子的感受器［14］。本研究发现，CCND1 rs1352075位点多态性与PE发生风险降低有关。与NUZZO等［15］结论类似，即PE患者胎盘间充质干细胞（PDMSC）中的CCND1的表达水平显著下调。进一步研究表明，PE-PDMSC中CCND1-p16INK4C/p18INK4C通路的改变导致异常的绒毛结构，从而参与PE的发生［16］。多项研究表明，CCND1基因富集于与PE相关的通路，如AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）信号通路和FoxO1信号通路［17-18］。此外，研究发现CCND1在多种肿瘤中过表达，进而促进肿瘤细胞血管的生成［19-20］。鉴于PE与癌症的发病机制存在相似性，包括血管网络的建立、促进生长以及调节免疫抑制等基本过程［21］，提示CCND1基因可能在PE发病过程中具有重要的调控作用。生物信息学研究发现，rs1352075位点在与胎盘发育和脐静脉形成密切相关的细胞类型中的启动子区域具有较高的活性。提示其可能是一个重要的基因表达调控区域，在CCND1基因表达调控中可能发挥关键作用。scATAC-seq提示该位点可能在血管内皮细胞、基质细胞中发挥作用，对于维持血管和其他组织形成和功能至关重要。综上所述，这些发现进一步支持了rs1352075在PE发病机制中的重要作用。
CCNE1基因是细胞进入S期的重要调节因子［22］。本研究发现，CCNE1 rs3218070位点多态性与PE发生风险增加相关。目前关于CCNE1基因与PE的关联研究较少，DELOIA等［11］研究表明CCNE1在绒毛滋养层中起主要作用，可能参与滋养层末端分化。此外，GAO等［12］在PE患者脐带静脉内皮细胞中发现CCNE1基因的mRNA和蛋白水平显著降低，提示CCNE1基因表达水平下调可能通过影响细胞增殖、迁移和侵袭等途径参与PE的发生。AKCORA YILDIZ等［23］研究发现，与对照组相比，PE孕妇胎盘中CCNE1的磷酸化水平显著降低。生物信息学研究发现，尽管3DSNP数据库评分显示rs3218070在三维基因组结构中功能较弱，但scATAC-seq显示该位点与血管及胎盘形成相关的细胞调控因子结合位点较多，表明其可能在CCNE1基因的表达调控中发挥重要作用。综上表明，CCNE1 rs3218070可能是一个功能性的遗传变异，对CCNE1基因的表达调控有重要影响，可以作为研究基因表达调控机制和开发新治疗方法的重要靶点。
本研究通过叉生分析探索CCND1以及CCNE1基因之间可能的交互作用。结果显示，CCND1 rs1352075和CCNE1 rs3218070位点间不存在相加交互作用。考虑各基因在细胞周期调控中的重要作用，笔者认为未来应扩大研究人群，涵盖不同地区和人种，以进一步探索候选基因在PE发生机制中的作用。广泛开展基因-基因交互作用的研究将有助于更好地解释PE的复杂发病机制，为其精准医疗和个性化治疗提供新的线索。
相较于以往研究，本研究具有以下优势：首先，本研究探索了孕妇CCND1和CCNE1基因多态性与PE发生的关联。其次，本研究探讨上述基因多个SNP位点间的交互作用与PE发生风险的关系。这些发现为预测和干预PE提供了新的方向，有望降低PE发病率，提升母婴健康水平。此外，本研究仍存在一些局限性：由于伦理限制，本研究并未获取胎盘组织进行CCND1和CCNE1基因的表达进行研究，限制了对PE发病机制的深入探索；研究仅探讨了两个与细胞周期调控相关的基因与PE的关联，未来研究应拓展基因范围，关注更多细胞周期调控基因与PE发病之间的关联。
综上所述，本研究发现CCND1 rs1352075和CCNE1 rs3218070多态性与PE易感性相关。CCND1 rs1352075位点携带CC基因型和CCNE1 rs3218070位点携带GG基因型可能与PE发生风险升高有关。
参考文献略
