基因操作工具-慢病毒

2011-11-01 00:00 来源:上海生博 作者:
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重组慢病毒简介、安全操作规范

重组慢病毒简介

在转染遗传物质到细胞基因组中的工作中,重组慢病毒载体是一个强大和有效的工具(Ausubel et al., 1995; Coffin et al., 1996)。慢病毒能作用于细胞周期的G0/G1期,同时具有嗜核性,所以可以感染分裂期细胞和非分裂期细胞,感染包括几乎所有的哺乳动物细胞、干细胞和原代培养的细胞。慢病毒载体还具有转移的基因片段容量较大(9 kb)、目的基因可整合至靶细胞基因组长期表达、免疫反应小等优点。所以获得了较广的应用范围。

慢病毒载体也是RNAi表达的主要手段(Sachdeva et al., 2007),同化学合成和酶切形成的siRNA相比具有几个优点:其一,可以携带GFP或萤光素酶等报告基因共表达,便于跟踪、选择和富集转染的细胞;其二,可以根据需要表达不同类型的小RNA分子(siRNA、shRNA或miRNA);其三,具有较高的转染效率,使基因沉默维持较长时间(Li MJ et al., 2003)。

目前Pubmed中收录有关慢病毒载体用作实验的文章超过7万多篇,仅Nature,,Science,,Cell上便超过600篇。已成为国际上最通用的转染系统,广泛用于各类实验室。

慢病毒的安全操作规范

上海生博提供的慢病毒均采用第二代系统的慢病毒载体。水泡性口炎病毒来源的VSV-G基因代替HIV-1的env基因,这既提高了慢病毒的安全性,又使其能够感染的细胞种类大大增加。

本系统的慢病毒颗粒是“自身失活型(SIV)”,整合入靶细胞后,不会产生完整长度的RNA,仅仅具有携带目的基因的功能,感染目的细胞后不再感染其他细胞,也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。

尽管如此,该病毒仍然具有潜在的生物学危险性,因此建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假性病毒;并强烈建议将本系统生产的慢病毒视为二级生物安全水平的生物,而且严格遵守BSL-2或BSL-2+操作手册并进行相应的废弃物消毒。基本操作规范如下:

1. 在实验室工作时,任何时候都必须穿着连体衣、隔离服或工作服;应戴上合适的手套和口罩。

2. 病毒操作时最好使用生物安全柜。如果使用普通的超净工作台操作病毒,请不要打开风机。

3. 所有的技术操作要按尽量减少气溶胶和微小液滴形成的方式来进行。如果出现病毒污染,请立即用70%的酒精加1%SDS溶液擦拭干净。

4. 如需离心,应使用密封性好的离心管,可用Parafilm膜封口后离心,而且最好使用组织或细胞培养室内的离心机。

5. 用显微镜观察细胞感染情况时用遵从以下步骤:拧紧培养瓶或盖紧培养板,并在使用70%乙醇清理所有受到污染的材料、标本和培养物在废弃或清洁再利用之前,必须清除污染。废弃的含病毒的培养基加入84消毒液(1:20左右),浸泡一天后丢弃。接触过病毒的枪头,离心管,培养板等其他物品可用84消毒液稀释液处理,也可以用煮沸处理半小时或高压湿热灭菌(121℃,30min)。

6. 手套用完后,应先消毒再摘除,随后必须洗手。

详细操作规范请参阅卫生部发布的《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》(WS233-2002)、美国疾病控制中心出版的《微生物和生物医学实验生物安全(第五版)》和世界卫生组织出版《WHO生物安全手册》。操作慢病毒时请依照现有的使用指南。

 

包装细胞293T细胞的培养

(下述流程来自上海生博Lenti-Center,如果使用不同公司系统请参考各公司提供的方案,本流程仅供参考)

一、293T细胞的冻存

1. 随着传代的次数增加,293T细胞会出现生长状态下降,出现突变等。所以要在细胞购进时就进行大2. 在细胞对数生长期进行冻存,增加细胞复苏成活率。

3. 倒去细胞上清液,加入D-Hank's液洗去残留的培养基。

4. 加入0.25%的胰酶,消化10-20s后倒去。

5. 镜下观察细胞变圆,细胞间间隙加大时,加入新鲜培养基吹打混匀。

6. 细胞计数。

7.将细胞离心,1000rpm,2min。

8. 根据计数结果加入细胞冻存液(70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO)重悬细胞,密度为3×106个/ml。

10. 第二天将细胞放入液氮灌,并记录。

二、293T细胞的传代

1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作,以扩大细胞数量,维持细胞良好的生长状态。

2. 消化细胞,方法同上。

3. 细胞离心结束后,加入完全培养基重悬。密度为3×105个/ml。

4. 分到10cm培养皿中,10ml/皿。

三、293T细胞的复苏

1. 当细胞传代次数过多(超过50代),细胞状态变差时或细胞出现污染事故时,需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。

2. 打开水浴锅,设置温度为40℃。

3. 查看细胞库记录,根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞(需戴上棉手套,防止被冻伤),迅速丢入水浴锅中并快速晃动,在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。

4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。

5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。

6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基,加入10ml新鲜培养基。

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编辑: 陈

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