基因操作工具-慢病毒

2011-11-01 00:00 来源:上海生博 作者:
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病毒滴度的测定

稀释计数法

滴度单位:TU/ml,指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。”TU”为”transducing units”的缩写,中文为“转导单位”,表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。

第一天 细胞准备

将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×105/ml,加入96孔板,100μl/孔,为每个病毒准备10个孔。放入37℃,5%CO2培养箱中培养。

第二天 加病毒

在EP管中做10倍梯度稀释,连续10个稀释度。稀释方法如下:每种病毒准备10个1.5ml EP管,每管加入90μl培养液,往第一个管中加入10μl病毒原液,混匀后,吸取10μl加入第二个管混匀。依此类推,做十个稀释度(10~10-8)。

吸取96孔板中原有的培养基,加入含稀释好的病毒液。并做好标记。

第三天 追加培养液

在每个孔再加入100μl完全培养液,利于细胞的生长。

第五天 观察结果并计算滴度

在荧光显微镜下观察结果,并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为X和Y,则滴度(TU/ml)=(X+Y*10)*1000/2/X孔的病毒液的含量(μl)。

定量PCR法

病毒感染1天前,取6孔板接种HOS细胞。每孔细胞为5×104个。

接种细胞24小时后,取两个孔的细胞用血球计数板计数,确定感染时细胞的实际数目,记为N。

弃去其他培养板中的培养基,更换为含有5μg/ml polybrene的新鲜培养基。将浓缩病毒用培养基稀释200倍,也就是取1μl病毒加入到199μl的培养基中。在3个培养孔中分别加入0.5μl,5μl和50μl的稀释病毒。

感染开始后20小时,除去培养上清,换为500μl含DNaseI (Takara Mirus Bio,终浓度为10 U/ml)的新鲜培养基。在37℃消化15分钟,这一步是要除去残余的质粒DNA。然后换为2ml正常的培养基,继续培养48小时。

用0.5ml 0.25%胰酶-EDTA溶液消化细胞,在37℃放置1分钟。用培养基吹洗下,离心收集细胞。按照DNeasy试剂盒的说明抽提基因组DNA。每个样品管中加入200μl洗脱液洗下DNA。用DNA定量试剂盒定量(Bio-Rad)。基因组DNA可以稳定保存在-20℃至少2个月。

准备PCR所需的试剂和样品。为病毒序列检测引物配总管Ⅰ:

2× TaqMan Master Mix 25 μl × n 
Forward primer (100 pmol ml-1) 0.1μl × n
Reverse primer (100 pmol ml-1) 0.1μl × n
Probe (100 pmol ml-1) 0.1μl × n 
H2 19.7μl × n 

n = number of reactions. 例如:总反应数为40,将1ml 2× TaqMan Universal PCR Master Mix,4μl forward primer,4μl reverse primer,4μl probe 和788μl H2O混和。震荡后放在冰上。

为人基因组序列检测引物配总管Ⅱ:

2× TaqMan Master Mix 25 μl × n 
10×RNaseP primer/probe mix 2.5 μl × n 
H2 17.5μl × n 

n = number of reactions. 例如:总反应数为40,将1ml 2× TaqMan Universal PCR Master Mix,100μl 10×RNaseP primer/probe mix和700μl H2O混和。震荡后放在冰上。

在预冷的96孔PCR板上完成PCR体系建立。从总管Ⅰ中各取45μl加入到A-D各行的孔中,从总管Ⅱ中各取45μl加入到E-G各行的孔中。

分别取5μl质粒标准品和待测样品基因组DNA加入到A-D行中,每个样品重复1次。另留1个孔加入5μl的水做为无模板对照(no-template control)。

分别取5μl基因组标准品和待测样品基因组DNA加入到E-G行中,每个样品重复1次。另留1个孔加入5μl的水做为无模板对照(no-template control)。

所使用定量PCR仪为ABI PRISM 7000定量系统。循环条件设定为: 50℃ 2分钟,95℃ 10分钟,然后是95℃ 15秒,60℃ 1分钟的40个循环。

数据分析:测得的DNA样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定,得到每基因组整合的病毒拷贝数。

滴度(integration units per ml,IU ml-1)的计算公式如下:

IU ml-1 = (C ×N× D×1000)/V

其中: C = 平均每基因组整合的病毒拷贝数 

 N = 感染时细胞的数目(约为1×105) 

 D = 病毒载体的稀释倍数 

 V = 加入的稀释病毒的体积数 

 

慢病毒的储存与稀释

慢病毒的储存

1. 病毒的运输采用干冰保温,收到病毒液后若几天内用于实验,可于4℃保存(于一周内用完)。

2. 若病毒量较大,需长期保存。则根据每次实验用量分装后放于-80℃冰箱。一般病毒可以放于-80℃约12个月以上,但若超过6个月后使用,请重新检测病毒滴度。

3. 避免反复冻融,否则会降低病毒滴度。每次冻融会降低病毒滴度10%。

慢病毒的稀释

需要稀释病毒时,将病毒取出后置于冰上融解,用细胞培养用D-Hank's、PBS或培养基稀释到所需浓度后混匀分装后4℃保存,并尽快用于实验(于一周内用完)。

慢病毒在细胞水平的使用

什么是MOI?

“MOI”为”multiplicity of infection”的缩写,中文为“感染复数”或“复感染指数”,含义为感染时病毒和细胞数量的比值,即平均每个细胞感染的病毒活性单位数(TU number /cell)。在实验中将某种细胞感染达到80%时的MOI定义为这种细胞的MOI。

MOI与整合事件以及目的基因的表达相关。一定范围内,表达水平和MOI呈正相关。MOI取决于多种因素,如细胞状态,目的基因的大小与性质,细胞的感染效率等。所以,实验前需查阅相关文献,确定慢病毒对目的细胞的亲嗜性、MOI以及在体(in vivo)注射所需病毒量。若无文献支持,可以通过预实验得到合适的MOI。实际上,即使有文献支持,但由于所用细胞代数、细胞状态以及目的基因的差异,实际的MOI和文献报道也会不同,所以要安排预实验以确定所需MOI以及病毒对细胞生长的影响。

 

目的细胞感染预实验及实验体系的放大

实验目的:确定细胞感染所需的MOI,以及是否需要添加感染增强剂Polybrene。

实验材料:96孔板,1.5ml EP管,长势良好的目的细胞一瓶,已知滴度的慢病毒溶液,Polybrene(10mg/ml),目的细胞培养基等。

第一天:细胞准备

将长势良好的目的细胞接种到96板,消化好细胞(悬浮细胞不需要消化,直接离心收集细胞后加新鲜培养基重悬即可)后把浓度调为3×104~5×104个/ml,按90μl/孔加入。接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同,一般是保证第二天进行病毒感染时细胞汇合率介于30~50%之间。

第二天:病毒感染

感染实验分两组,一组直接添加病毒液,一组同时添加Polybrene。病毒稀释方法同病毒滴度测定时方法,10倍倍比稀释,共三个稀释度,MOI值依次为100,10和1(细胞经过一天的生长数量约为1×104个/孔,对应的病毒数量为1×106TU、1×105TU和1×104TU)。每个MOI值加两个孔,取出一组加入感染增强剂,比例为1:2000,终浓度为5μg/ml。

第二天:换液

感染实验同一天,8-12小时后,弃去上清液,更换为新鲜培养基,100μl/孔。

第五天:观察荧光表达情况

在倒置荧光显微镜下观察荧光,估计慢病毒感染目的细胞的效率。对于生长缓慢的细胞,可以适当推迟观察的时间,中途可以传代和换液,以保持细胞良好的生长状态。通过细胞感染的效果,确认目的细胞的感染MOI以及是否需要添加Polybrene。

对于因目的基因较大,载体无法携带标志基因的,可以通过定量PCR来检测目的基因的表达来评估感染效率。

实验体系的放大

正式实验时,由于细胞数量较大,所需的病毒用量也需相应增大。放大的原则是保持细胞的密度不变,将培养基体积,病毒量按实际细胞数与预实验细胞数的比例放大。即使这样,正式实验时由于体系的改变,加上预实验的MOI值设置跨度较大,可进行对MOI的再次优化。MOI的设置值为预实验最佳值0.5倍,1倍和1.5倍或自己设置合理的数值。

表1.病毒感染细胞所用培养基体积和病毒量参考值

  单孔底面积(cm2) 正常培养体积(μl) 感染时体积(μl) MOI=1 病毒量(TU)  MOI=10 病毒量(TU)  MOI=100病毒量(TU
96孔板  0.3 100 100 1×104 1×104 1×104
48孔板 0.6 200 200 2×104 2×105 2×106
24孔板  1.9 500 500 6×104 6×105 6×106
12孔板  3.8  1000 500 2×105 6×106 6×107
6孔板 9.5 2000 1000 2×105 2×106 2×107
T25瓶 25 5000 2500 5×105  5×106 5×107

*表中可培养板底参数数值为CORNING公司产品参数。

*对于孔面积较小的培养板,由于溶液张力的关系,培养基体积太少会导致病毒的分布不均与,所以不做减半处理。

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编辑: 陈

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