近年来，作为一种神经保护药的红细胞生成素（erythrop oietin，EPO）成为研究热点。EPO是一种相对分子质量约为30×103（30 kD）的热（80℃）稳定性糖蛋白。外周EPO的相对分子质量为35 kD，而脑源性EPO为33 kD，两者的差异可能与脑源性EPO的低唾液酸化有关。EPO及其受体的表达见于多种组织。大量基础和小样本临床试验均显示，EPO具有神经保护作用。研究证实，EPO与其受体结合后，可引起受体二聚化，激活下游多条通路，最终改变促凋亡/凋亡蛋白的比例，发挥抗凋亡作用；抑制炎性因子表达，发挥抗炎作用；抑制自由基生成引起的氧化毒性；通过促进内皮祖细胞和神经干细胞增殖分化，促进血管和神经发生；通过减少谷氨酸释放并增加重摄取，对抗兴奋性氨基酸毒性；降低缺血级联反应导致的血脑屏障（brain-blood barrier，BBB）破坏性物质的表达，减轻BBB损伤；对新生儿脑缺血缺氧也具有很好的保护作用。
迄今为止，EPO的研究主要集中在4个方面：（1）具体的神经保护机制；（2）给药途径；（3）最佳剂量和时间窗；（4）不良反应和3种衍生物。尽管对其神经保护机制进行了大量研究，但Souvenir等认为EPO研究很少能进行临床转化，因其详细机制不明，而且通路中的关键信号分子也不确定。很多实验研究对EPO的药代学特性、最佳时间窗及最佳剂量进行了探索。一项汇总分析显示，早期（6h内）大剂量应用EPO可显著改善脑缺血模型动物的预后，但至今仍无动物或人的EPO量效曲线。长期大量外周应用，可因促进红细胞过量生成而出现严重的不良反应，因此已研发出多种EPO衍生物，如氨基甲酰化EPO（carbamy lated EPO，CEPO）、乏唾液酸基EPO（asialoerythropoietin，asialo-EPO）、少唾液酸的重组人EPO[即神经元EPO（neu-ronal EPO， Neuro-EPO）]。一些实验证实它们与一般EPO效果相同，但另一些研究则显示这3种衍生物的受体不同于EPO，缺乏促进血管发生和保护BBB完整性的作用，因此效果不如EPO。2008年，在德国进行的一项多中心临床试验显示，在重组组织型纤溶酶原激活剂（recombinant tissueplasminogen activator，rtPA）静脉溶栓后使用EPO，缺血性卒中患者的病死率增高。
面对EPO研究结果的不一致，现重点对EPO在脑缺血神经保护的基础和临床研究中存在的问题进行综述，以促进EPO的进一步研究。
1 基础研究
1.1 实验动物
Jerndal等对19项基础研究进行分析后认为，实验研究多采用正常动物，且多数仅进行组织学评价，只有7.5%采用的是高血压动物并进行了神经功能评分，因此不能很好地模拟临床；同时，很多基础研究未进行合理的偏倚控制，因此有可能夸大EPO的效果。Lapchak也提出，现有EPO基础研究质量不高，可能夸大了其安全性和疗效。
1.2给药途径
BBB是药物进出脑组织的重要门户，其特征性结构是跨膜蛋白及黏附分子构成的紧密连接。药物的生化特性决定了其运输方式，相对分子质量＞0.6 kD的脂溶性药物几乎不能通过BBB，作为水溶性药物的EPO通透性更低。有报道显示，外周应用EPO可在脑内达到足够的治疗浓度，但需较大剂量。因此，后续研究采用了很多给药方式，如构建各种EPO融合蛋白、经鼻给药、脑内和脑室内给药等，但其中的一些方法在临床实践中并不可行。
尽管大分子物质很难通过BBB，但脑血管内皮细胞上存在很多大分子物质（如转铁蛋白、胰岛素、胰岛素样生长因子）的受体，因此可通过受体介导进入脑组织。Brines等首次证实，脑血管内皮细胞上也存在大量EPO受体，EPO可通过受体介导进入脑内而发挥作用。很多实验室构建了可介导EPO进入脑内的融合蛋白。例如，将人EPO重新设计为IgG-EPO融合蛋白，其中IgG部分为抗人胰岛素受体（insulin receptor，HIR）单克隆抗体（monoclonal antibody，MAb），整个融合蛋白即为HIRMAb-EPO；将EPO融合至小鼠抗转铁蛋白受体（transferrin receptor，TfR）嵌合MAb的重链设计成转铁蛋白受体单抗-EPO，即cTfRMAb-EPO。研究显示，大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）小鼠静脉注射后，这2种融合蛋白均能很好地通过BBB；免疫组化染色和神经功能评分均显示，其神经保护作用显著优于EPO，且在外周循环中的浓度很低，不良反应也很少。Zhang等通过将来自人免疫缺陷病毒的TAT蛋白转导序列连接到EPO设计出一种融合蛋白EPO-TAT，其通过BBB的能力显著提高，腹腔和静脉注射后脑组织内浓度分别为EPO的2倍和5倍。虽然业已证实很多融合蛋白可更好地通过BBB而发挥作用，但目前仍处于基础研究阶段，其安全性仍有待进一步研究。
有学者认为，卒中后BBB破坏是EPO进入脑组织的主要原因。MRI研究显示，动物脑缺血再灌注后的BBB通透性改变呈双相，第1期为再灌注后4～5 h，第2期为48 h，但卒中患者是否存在类似的特征尚不清楚。卒中后BBB通透性增加具有时间和空间异质性，影响因素包括缺血类型、严重程度和持续时间，因此依赖于BBB破坏导致的通透性增加存在一定的风险。另外，EPO本身可保护BBB的完整性，自身通过率也会降低；外周大剂量应用可能会产生严重的不良反应；某些EPO衍生物（如Neuro-EPO）的半衰期仅为数分钟，因此需要寻找其他高效的给药途径。虽然EPO基础研究已对多种给药方式，如经鼻腔给药、脑内及脑室内给药等进行了探讨，但目前均处于实验研究阶段。
嗅上皮含有很多双极神经元，其轴突形成神经束通过筛板入脑内。因此，EPO经鼻应用可绕过BBB，避免了外周不良反应和被肝脏清除，并且快速高效。经鼻给药涉及2种转运机制：（1）药物通过内吞进入嗅上皮初级神经元，然后经轴突转运进入嗅球；（2）药物经细胞旁途径跨嗅上皮层快速吸收，然后进入脑内。Hermann认为，啮齿类及非人灵长类动物EPO经鼻用药后会很快出现在脑脊液内，提示其并非通过轴浆运输进入脑内，具体机制不明。实验证明，经鼻和腹腔注射给予同样剂量的EPO时，前者效果更好；当通过2种给药途径的疗效同样时，则前者的血液学不良反应较轻。Gao等对永久性脑缺血沙土鼠经鼻应用EPO的研究显示，EPO组动物死亡率显著降低，而且感觉运动功能有所改善，表明经鼻应用EPO是一种有效的治疗手段；脑缺血后10～60 min是经鼻应用EPO的最佳时间，1～3 d后给药效果较差。然而，人经鼻给药的效率并不高，因为人嗅上皮覆盖率远远低于啮齿类动物（3%～5%对50%），而且脑脊液容积和更新率也存在很大差异。EPO经鼻腔进入后，首先聚集在嗅球投射区，主要在前脑基底部，距缺血区的距离很远。虽然研究显示EPO经鼻应用数分钟后即可在猴脑脊液中检测到，但并未检测受损区EPO浓度是否达到治疗浓度。脑脊液与脑组织之间无接触限制，分子可自由通过，很多研究证实脑室内注射EPO的保护效果良好。Zhang等报道，四血管闭塞模型大鼠脑室内应用EPO，可增加Akt及其底物糖原合酶激酶磷酸化以及脑源性神经营养因子的生成，从而在脑缺血时具有保护作用；EPO脑室内给药的时间窗为缺血前20 h及后20 min内，1 h后则无保护作用。Sakanaka等将EPO注入脑缺血沙土鼠侧脑室发现，海马CA1区神经元损伤显著减轻，动物认知能力显著改善。不过，脑室内给药后药物仍需扩散方能到达损伤部位，且脑脊液的快速更新可能会降低注射药物的利用度，因此不适用于急性期治疗。另外，脑和脑室内给药存在以下缺点：（1）为有创性操作，可能导致并发症；（2）注入后仍需在脑组织中继续扩散，受药物分子量和组织特性的影响；（3）脑内组织的可扩张性限制了注入药量。
1.3 最佳剂量及时间窗
与其他神经保护药，如碱性成纤维细胞生长因子、白细胞介素类、肿瘤坏死因子等一样，EPO仅在一定浓度范围内起保护作用，过低或过高均无效或有害。至今尚无啮齿类动物和人EPO外周应用的量效曲线。实验研究表明，外周应用EPO后在未损伤小鼠脑组织中达峰时间为3h，半衰期为5～6 h。新生大鼠MCAO模型实验显示，立即给予单次剂量EPO并不能缩小梗死体积，而3次给药可缩小梗死体积并减轻神经功能缺损，提示EPO多次用药的效果优于单次给药，但最佳时间间隔和单次剂量未知。不少研究显示，EPO在脑梗死后6h内外周应用具有很好的保护作用。一项汇总分析显示，及早（6 h内）大剂量应用EPO可缩小梗死体积和改善功能转归。然而，Siren的研究表明，在脑缺血后3h内静脉应用EPO可挽救大部分缺血神经元，而6h时应用仅能挽救少数神经元。因此，EPO外周应用的最佳剂量及最佳时间窗争议很大，需要继续研究。
1.4 不良反应和3种衍生物
长期外周大剂量应用EPO可产生严重的血液学不良反应，而使用EPO衍生物则可避免。Neuro-EPO不含内源性EPO具有的修饰成分，可能更适合人体，但半衰期仅为数分钟，因此只能选择局部给药。尽管有关EPO的机制有很多研究，但具体和确切的神经保护机制尚不完全清楚，而3种衍生物的受体及通路是否有其独特性更是知之甚少。研究显示，EPO发挥神经保护作用的受体不同于促红细胞生成作用的受体，这种独特的受体由EPO受体及CD131（又称β共同受体）构成，与EPO的亲和力很低，3种EPO衍生物均通过其发挥作用。Wang等的研究证实，EPO和CEPO均可具有神经保护作用，但EPO组可显著增高红细胞比容，而CEPO组红细胞比容则无显著改变，表明CEPO无血液学不良反应。Villa等指出，3种EPO衍生物可降低髓过氧化物酶、CD68、GFAP、Tau-1、半暗带小胶质细胞激活以及多形核白细胞浸润，减轻白质损伤，缩小最终梗死体积。Lapchak认为，CEPO的神经保护机制与形态发生素和Sonic HedgeHog有关。虽然长期大量.外周应用EPO衍生物不会产生血液学不良反应，但经典的EPO可作用于血管内皮细胞上的EPO受体，从而降低BBB通透性和促进血管生成，而这3种衍生物可能并不存在这些效应。
2 临床研究
2002年，Ehrenreich等首次在53例缺血卒中患者中静脉应用EPO（3.3×104 IU）证实EPO安全有效，能显著改善卒中发病后1个月时的神经功能转归。之后，在德国进行了一项多中心大样本临床Ⅱ/Ⅲ期试验，在522例急性大脑中动脉供血区梗死患者rtPA静脉溶栓后6h、24 h或48 h时应用EPO，结果显示，EPO非但不能改善卒中发病后90 d时的Barthel指数，反而会增高病死率（EPO组为16.4%，对照组为9%）。虽然病死率增高的具体机制未知，但至少说明接受rtPA治疗的缺血性卒中患者不宜应用EPO，之后的基础实验开始研究其中的机制。Jia等对大鼠MCAO后2h和6h联合应用EPO（腹腔注射）和rtPA（静脉注射）的效果进行了研究。结果表明，缺血后2h联合应用可显著缩小梗死体积，而且不会增高出血性转化发生率，但缺血后6h应用则不能减轻脑损伤并可增高脑出血风险；免疫组化染色显示，缺血后6h联合用药引起的基质金属蛋白酶-9/核因子-κB/白细胞介素受体-1相关激酶的上调可能是脑出血风险增高的原因。Zechariah等也证实，EPO可增加小鼠MCAO经rtPA治疗后的BBB通透性、细胞外基质降解和DNA破坏。
面对EPO基础实验和临床研究中出现的问题，很多专家提出了自己的观点。Hermann认为，EPO不能应用于rtPA溶栓患者，并不意味着EPO不能应用于临床，因为基础实验表明EPO即使在急性期后应用仍有强大的促进神经修复作用，因此建议进行啮齿类和灵长类动物神经EPO组织浓度比较的研究，从而指导EPO临床试验的剂量选择。Digicaylioglu也持相同观点，认为EPO的相对安全性（早已应用于贫血治疗）以及目前缺乏有效神经保护药的现状迫使我们继续进行EPO的保护作用研究。另外还指出，已有研究在给药途径、剂量、动物模型制作以及结果评价方面存在很大异质性，因此未来的神经保护药研究应严格遵守现有的卒中治疗学术工业圆桌会议（Stroke Therapy Academic Industry Roundtable，STAIR）指南。由于目前研究的异质性以及量效曲线的缺乏，德国临床试验的阴性结果并不成熟，在未来应采用新的参数和方法进行进一步的研究。Lapchak则认为，鉴于EPO在德国临床试验中的有害作用，应在栓塞性卒中模型中严格评价EPO的安全性，以降低试验失败可能性和对患者的危害性。
EPO早已应用于贫血的临床治疗，后来发现其具有神经保护作用，开始了至今20多年的EPO神经保护研究。EPO在基础和临床研究中存在很多问题，不能确切证明其作用。因此，应严格遵照STAIR指南的规定继续进行基础和临床研究。
